代谢组学和转录组学分析
鉴定N. caninum感染对宿主细胞代谢谱的影响
对N. caninum感染的EECs进行非靶向代谢组学和RNA-seq分析，检测代谢物变化和糖酵解相关基因表达。
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犬新孢子虫劫持宿主PFKFB3驱动的糖酵解以促进寄生虫的胞内增殖
Neospora caninum hijacks host PFKFB3-driven glycolysis to facilitate intracellular propagation of parasites.
实验完整度
高综合代谢组学、转录组学、体外细胞感染模型、体内小鼠模型、基因敲低、药物抑制及分子机制验证等多层次实验。
主要模型
山羊子宫内膜上皮细胞（EECs） 牛子宫内膜上皮细胞（BEND） BALB/c小鼠感染模型
重点核对
N. caninum感染剂量：2.5×10^7速殖子/小鼠，腹腔注射 药物处理浓度：2-DG 25和50 mM，草氨酸钠5 mM，3-PO 20 μM，SP600125 5 μM，LW6 40 μM，DMOG 200 μM 感染复数（MOI）：3:1（寄生虫:细胞） 检测时间点：体外48 hpi，体内5 dpi qPCR检测基于nc-5基因
摘要
感染犬新孢子虫会导致反刍动物（如牛和山羊）的繁殖失败；然而，目前尚无有效的疫苗或治疗方法来控制这种感染。严格调控宿主细胞的糖酵解对于病原体的胞内生存至关重要。尽管如此，犬新孢子虫感染对宿主细胞糖酵解的影响以及宿主细胞糖酵解对该寄生虫胞内生存的作用和机制仍不清楚。在本研究中，代谢组学和转录组学分析显示，犬新孢子虫感染增加了山羊子宫内膜上皮细胞（EECs）中糖酵解相关酶的表达和乳酸的产生。研究结果表明，使用2-DG或草氨酸钠（一种LDH-A抑制剂）抑制宿主细胞糖酵解，可抑制宿主细胞糖酵解和犬新孢子虫速殖子的胞内增殖。此外，补充乳酸可进一步促进犬新孢子虫速殖子在体内和体外的复制。进一步研究发现，犬新孢子虫感染通过上调6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（PFKFB3）的表达来诱导宿主细胞糖酵解，而用小干扰RNA或3-PO敲低PFKFB3可显著抑制体内和体外的宿主细胞糖酵解和犬新孢子虫速殖子的增殖。此外，机制研究表明，犬新孢子虫感染激活JNK信号通路并抑制HIF-1α的泛素化降解。染色质免疫沉淀和双荧光素酶报告基因实验表明，犬新孢子虫感染诱导HIF-1α的表达，HIF-1α与pfkfb3的启动子区域结合。我们的研究结果表明，细胞糖酵解可能作为新孢子虫病的一个潜在治疗靶点，为进一步研究犬新孢子虫的胞内生存机制提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 犬新孢子虫感染对宿主细胞糖酵解的影响以及宿主细胞糖酵解对寄生虫胞内生存的作用和机制。
- 核心机制
- 犬新孢子虫感染激活JNK信号通路，抑制HIF-1α的泛素化降解，促进HIF-1α表达并使其与pfkfb3启动子结合，上调PFKFB3表达，驱动宿主细胞糖酵解，从而促进寄生虫胞内增殖。
- 主要证据
- 代谢组学和转录组学显示感染后糖酵解相关酶和乳酸增加；2-DG、草氨酸钠、3-PO、siPFKFB3、SP600125和LW6处理抑制糖酵解并降低寄生虫载量；乳酸补充促进寄生虫复制；ChIP和双荧光素酶实验证实HIF-1α结合pfkfb3启动子。
- 研究意义
- 细胞糖酵解可作为新孢子虫病的潜在治疗靶点，为理解犬新孢子虫胞内生存机制提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证宿主细胞糖酵解被诱导
确认N. caninum感染是否诱导宿主细胞糖酵解
检测感染后EECs、BEND细胞和小鼠子宫组织中的葡萄糖消耗、乳酸产生和糖酵解酶表达。
抑制糖酵解对寄生虫增殖的影响
评估宿主细胞糖酵解是否促进N. caninum复制
使用2-DG、草氨酸钠、半乳糖或低葡萄糖处理感染细胞和小鼠，检测寄生虫载量和斑块大小。
验证PFKFB3在糖酵解中的作用
确定PFKFB3是否介导N. caninum诱导的糖酵解
使用3-PO或siPFKFB3处理EECs，检测Fru-2,6-P2含量、PFK1活性、乳酸、葡萄糖消耗和寄生虫增殖。
验证JNK信号通路的作用
探究JNK通路是否调控PFKFB3驱动的糖酵解和寄生虫增殖
使用SP600125处理感染细胞和小鼠，检测PFKFB3表达、糖酵解参数和寄生虫载量。
验证HIF-1α的作用
确定HIF-1α是否参与PFKFB3的转录调控
使用LW6或DMOG处理感染细胞和小鼠，检测HIF-1α、PFKFB3表达、糖酵解参数和寄生虫增殖；并通过ChIP和双荧光素酶实验验证HIF-1α与pfkfb3启动子结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Shanghai BasalMedia Technologies Co., Ltd. | -- |
| DMEM培养基 | Shanghai BasalMedia Technologies Co., Ltd. | -- | |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | -- | |
| D-(+)-半乳糖 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| D-(+)-葡萄糖 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 药物处理 | 3-PO | MedChemExpress | -- |
| SP600125 | MedChemExpress | -- | |
| 草氨酸钠 | MedChemExpress | -- | |
| 乳酸 | MedChemExpress | -- | |
| LW6 | MedChemExpress | -- | |
| DMOG | MedChemExpress | -- | |
| MG132 | MedChemExpress | -- | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒 | Zeta Life | -- |
| 代谢物检测 | 乳酸含量检测试剂盒 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- |
| 葡萄糖含量检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| PFK1活性检测试剂盒 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| 山羊Fru-2,6-P2含量检测试剂盒 | Jiangsu Jingmei Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| RNA干扰 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Accurate Biology | -- |
| Hifair® V逆转录酶 | Yeasen Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 2×Universal SYBR Green Fast RT-qPCR Mix | ABclonal | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗PFKFB3抗体 | HUABIO | -- | |
| 抗磷酸化PFKFB3抗体 | Abcam | -- | |
| 抗HIF-1α抗体 | Abcam | -- | |
| 抗LDH-A抗体 | Abmart | -- | |
| 抗JNK抗体 | Abmart | -- | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Abways | -- | |
| 抗p38MAPK抗体 | Abways | -- | |
| 抗磷酸化p38MAPK抗体 | Abmart | -- | |
| 抗Erk1/2抗体 | Abways | -- | |
| 抗磷酸化Erk1/2抗体 | Abways | -- | |
| 抗AMPK抗体 | Abways | -- | |
| 抗磷酸化AMPK抗体 | Abways | -- | |
| 抗Akt抗体 | Abmart | -- | |
| 抗磷酸化Akt抗体 | Abmart | -- | |
| 抗β-actin抗体 | Abways | -- | |
| 抗β-tubulin抗体 | Abways | -- | |
| HRP标记的驴抗兔抗体 | ABclonal | -- | |
| HRP标记的驴抗小鼠抗体 | Biotech | -- | |
| 增强化学发光系统 | Beijing Applygen Technologies Co., Ltd. | -- | |
| ChIP-qPCR | BeyoChIP™酶法ChIP检测试剂盒（Protein A/G磁珠） | Beyotime Biotechnology | -- |
| 微球菌核酸酶 | -- | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- |
| 免疫荧光 | FITC标记的驴抗兔抗体 | Abcam | -- |
| DAPI | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| 免疫沉淀和泛素化 | 免疫沉淀裂解液 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| 抗泛素抗体 | Abmart | -- | |
| 寄生虫复制分析 | 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外感染模型 | 细胞类型、细胞数量、培养时间、MOI、感染时间 阅读提示：Materials and methods: In vitro Neospora caninum infection models |
| 药物处理 | 药物浓度、处理时间、对照（无菌水或DMSO） 阅读提示：Materials and methods: In vitro Neospora caninum infection models |
| 动物实验 | 小鼠品系、周龄、体重、分组、感染剂量、给药剂量、给药途径、时间点 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments and sample collection |
| 糖酵解检测 | 检测方法、试剂盒、样本量 阅读提示：Materials and methods: Lactate measurement, Glucose content measurement, PFK1 activity measurement, Fru-2,6-P2 content detection |
| 分子机制验证 | siRNA序列、转染浓度、ChIP抗体量、荧光素酶报告质粒 阅读提示：Materials and methods: RNA interference test, ChIP-qPCR, Dual-luciferase reporter assay |