ACP原代细胞的分离与培养
从原发和复发ACP肿瘤组织中分离并稳定培养原代细胞。
患者0913（原发）和0824（复发）的肿瘤标本经机械解离和酶消化（人肿瘤解离试剂盒）制备单细胞悬液，离心洗涤后重悬于含5%FBS和20 ng/mL EGF的DMEM/F12培养基中，在37°C、5%CO2条件下培养，传代至80%密度。
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具有癌症相关成纤维细胞特征的成釉细胞型颅咽管瘤原代细胞的分离与鉴定
Isolation and Characterization of the Adamantinomatous Craniopharyngioma Primary Cells with Cancer-Associated Fibroblast Features.
实验完整度
高文献包含原代细胞分离、STR鉴定、WES突变分析、IF/IHC表型验证、转录组测序以及小鼠异种移植成瘤实验，涵盖细胞水平、分子水平和体内实验等多个独立证据层级。
主要模型
ACP原代细胞（0913，来源于原发肿瘤） ACP原代细胞（0824，来源于复发肿瘤） NCG小鼠皮下异种移植模型
重点核对
原代细胞来自1例原发和1例复发ACP患者，需核实患者ID 0913和0824的临床病理特征。 细胞培养条件：DMEM/F12培养基，5%FBS，20 ng/mL人EGF，37°C，5% CO2，传代密度接近80%。 异种移植实验：NCG小鼠皮下接种5×10^5个细胞（第7代），与Matrigel混合，分别观察14周（0824）和11周（0913）。 STR分析：检测20个STR位点，与细胞库数据比对，最高匹配率78.57%，排除交叉污染。 关键标记物：IF显示FSP1、Vimentin阳性，α-SMA仅少数细胞阳性，Fibronectin强阳性，β-catenin核转位。
摘要
背景：成釉细胞型颅咽管瘤（ACPs）是良性颅内肿瘤，但由于其位置、对周围神经组织的浸润以及高复发率而表现具有侵袭性。在本研究中，我们旨在构建ACP原代细胞模型，以进一步研究其致瘤和复发机制。方法：从原发性（1例）和复发性（1例）ACP中分离原代细胞。使用短串联重复序列（STR）分析来鉴定我们分离的ACP原代细胞的身份。对原代细胞和相应的ACP组织进行全外显子组测序（WES）、免疫荧光（IF）和免疫组织化学（IHC），以确定突变谱并阐明原代细胞的组织来源和表型。进行转录组RNA-seq以获得ACP原代细胞的基因表达特征。随后，建立异位ACP异种移植小鼠模型以确认ACP原代细胞的致瘤能力。结果：成功培养了ACP原代细胞。遗传变异与原始肿瘤组织相似，并且它们表达癌症相关成纤维细胞（CAF）标志物（FSP1/S100A4、Vimentin）和核转位β-catenin。同时，它们高表达细胞外基质成分（Fibronectin）。验证了ACP原代细胞的成瘤能力。还探索了ACP原代细胞的转录特征。结论：我们成功分离并鉴定了获得多种CAF特征并可通过数十代稳定传代的ACP原代细胞。这些PDC模型为进一步研究ACP奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何建立稳定的成釉细胞型颅咽管瘤原代细胞模型，并明确其组织来源、表型特征和致瘤能力，以研究肿瘤发生和复发机制。
- 核心机制
- ACP原代细胞获得CAF特征（表达FSP1、Vimentin、Fibronectin），且β-catenin核转位；转录组显示ECM重塑、EMT、免疫抑制等通路富集，提示CAF可能通过ECM重塑、EMT和免疫抑制微环境促进肿瘤发生。
- 主要证据
- 从1例原发和1例复发ACP中分离的原代细胞表达CAF标志物，WES显示与亲本组织有同源突变，IF/IHC定位在纤维间质区域，异种移植形成具有栅栏状上皮结构的肿瘤，RNA-seq显示CAF相关通路富集。
- 研究意义
- 研究提供了具有CAF特征的ACP原代细胞模型，为机制研究和药物筛选（如靶向Fibronectin）提供了平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
原代细胞的STR鉴定
验证原代细胞的细胞身份，排除交叉污染。
使用TIANamp基因组DNA试剂盒提取约1×10^6个细胞（第6代）的DNA，通过MicroreaderTM21 ID系统扩增20个STR位点和性别鉴定位点，利用GenReader 7010遗传分析仪检测，并用GeneMapper Software6分析结果，与细胞库数据库比对。
组织来源确认（WES和IF/IHC）
确定原代细胞与亲本肿瘤组织的同源性及细胞身份。
对亲本肿瘤组织进行全外显子组测序，与原代细胞的SNP比较；对原代细胞和肿瘤组织切片进行IF/IHC染色，检测pan-CK、EpCAM、FSP1、Vimentin、β-catenin、α-SMA和Fibronectin的表达。
小鼠皮下异种移植成瘤实验
验证ACP原代细胞的体内致瘤能力。
将第7代的0913和0824细胞各5×10^5个与Matrigel混合，皮下注射到8周龄雄性NCG小鼠右侧腹肋部，分别观察14周（0824）和11周（0913），触摸到肿块后颈椎脱臼处死，取移植瘤进行后续实验。
转录组测序及生物信息学分析
揭示ACP原代细胞的基因表达特征和差异通路。
对第6代的0913和0824细胞进行RNA-seq，使用Illumina NovaSeq平台测序，进行差异表达分析，并利用GO、KEGG和GSEA分析富集通路，比较与正常脑组织的差异以及原发与复发细胞间的差异。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 人肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胎牛血清 | YuanHeng ShengMa Biology Technology Research Institute | -- | |
| 人EGF蛋白 | Sino Biological | -- | |
| CO2培养箱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| 动物实验 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| NCG小鼠 | Jiangsu GemPharmatech LLC. | -- | |
| 组织染色 | 伊红溶液 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 正常山羊血清 | Solarbio | -- |
| DAPI | Solarbio | -- | |
| 抗荧光衰减封片剂 | Solarbio | -- | |
| pan-CK小鼠单克隆抗体 | Abcam | ab7753 | |
| EpCAM小鼠单克隆抗体 | CST | 2929 | |
| FSP1/S100A4兔单克隆抗体 | ABclonal | A19109 | |
| Vimentin兔单克隆抗体 | CST | 5741T | |
| β-catenin兔单克隆抗体 | ABclonal | A19657 | |
| α-SMA兔单克隆抗体 | CST | 19245 | |
| Fibronectin兔单克隆抗体 | ABclonal | A23830 | |
| ABflo 488偶联的山羊抗兔IgG | ABclonal | AS053 | |
| ABflo 594偶联的山羊抗小鼠IgG | ABclonal | AS054 | |
| 免疫组织化学 | HRP偶联的抗兔二抗 | Beyotime | P0615 |
| 全外显子组测序 | Agilent SureSelect人全外显子V6 | Agilent | 5190-8864 |
| 短串联重复序列分析 | TIANamp基因组DNA试剂盒 | TIANGEN | -- |
| MicroreaderTM21 ID系统 | -- | -- | |
| GenReader 7010遗传分析仪 | Microread | -- | |
| GeneMapper Software6 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 转录组测序 | RNA Nano 6000检测试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| Bioanalyzer 2100系统 | Agilent Technologies | -- | |
| AMPure XP系统 | Beckman Coulter | -- | |
| cBot簇生成系统 | Illumina | -- | |
| TruSeq PE簇生成试剂盒v3-cBot-HS | Illumina | -- | |
| Illumina NovaSeq平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原代细胞培养 | 患者来源（原发/复发），细胞株名称（0913/0824），培养基配方（DMEM/F12含5%FBS和20 ng/mL EGF），培养条件（37°C、5%CO2），传代密度（约80%），传代代数。 阅读提示：见 Methods 2.2 和 Results 3.1 |
| STR分析 | 细胞数量（约1×10^6），细胞代数（G6），使用的试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit），STR位点（20个位点），检测设备（GenReader 7010），比对数据库（ExPASy）。 阅读提示：见 Methods 2.8 和 Results 3.2 |
| WES | 样本类型（肿瘤组织FFPE），DNA用量（0.4 μg），捕获试剂盒（Agilent SureSelect Human All Exon V6），测序平台和数据分析方法需参考补充材料。 阅读提示：见 Methods 2.7 和 Supplementary Information Document S1 |
| 免疫荧光/免疫组织化学 | 一抗/二抗的种类和稀释比例（如pan-CK 1:500, EpCAM 1:800等），抗原修复条件，染色步骤。 阅读提示：见 Methods 2.5 和 2.6 及 Figure 2 和 3 的图注 |
| 异种移植 | 小鼠品系（NCG）、性别（雄性）、周龄（8周）、细胞代数（7代）、细胞量（5×10^5）、Matrigel用量、接种部位（右侧腹肋部）、观察时间（14周/11周）、每组动物数（文中未明确说明）。 阅读提示：见 Methods 2.3 和 Results 3.5 |
| 转录组测序 | 细胞数量（约1×10^6）、代数（G6）、RNA质量检测、文库构建和测序平台（Illumina NovaSeq），数据分析流程（HISAT2、DESeq2等）。 阅读提示：见 Methods 2.9 和 2.10 及 Results 3.6 |