PDCL3通过VEGFR-2在胶质瘤环境中促进胶质瘤相关间充质干细胞的血管生成拟态

PDCL3 promotes the vasculogenic mimicry of glioma-associated mesenchymal stem cells through VEGFR-2 in glioma environment.

作者信息Yihao Wang, Zhen Liu, Dongye Yi, Sujie Gu, Zesheng Peng, Haofei Wang, Peng Lv, Wei Xiang, Xiaobing Jiang, Peng Fu

PMID40469100

期刊iScience

发布时间2025-04-18

DOI10.1016/j.isci.2025.112473

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实验完整度

高

包含体外细胞模型（GA-MSCs、HUVECs）、基因敲低/过表达、蛋白质互作验证（Co-IP）、体内原位移植瘤模型及组织学分析，具有功能与机制验证。

主要模型

胶质瘤相关间充质干细胞（GA-MSCs）人脐静脉内皮细胞（HUVECs）胶质瘤干细胞（GSCs） BALB/c裸鼠原位移植瘤模型

重点核对

PDCL3敲低对GA-MSCs分化和血管生成拟态的影响 PDCL3与VEGFR-2的相互作用外源VEGF处理对GA-MSCs血管生成拟态的影响 VEGFR-2过表达对PDCL3敲低效应的挽救动物实验中GA-MSCs与GSCs共植入的肿瘤体积和血管标记物表达

摘要

微环境；分子生物学；细胞生物学；癌症

GA-MSCs与GSCs的分离与鉴定

验证所得细胞符合MSCs和GSCs的特征。

从人胶质瘤标本中分离GA-MSCs，通过表面标记物流式鉴定和多向分化实验验证其MSC特性；GSCs通过悬浮和贴壁培养及标记物免疫荧光验证。

胶质瘤环境对GA-MSCs周细胞分化的影响

检测胶质瘤条件培养基对GA-MSCs血管生成拟态和周细胞标记物表达的影响。

用U87-CM和GSC-CM处理GA-MSCs，进行试管形成实验和western blot检测周细胞标记物（α-SMA、DESMIN），以及免疫荧光染色。

筛选PDCL3作为关键基因

鉴定在胶质瘤条件下GA-MSCs中变化显著的血管生成相关基因。

对DMEM和GSC-CM处理的GA-MSCs进行基因微阵列分析，筛选差异表达基因，通过生信分析选择PDCL3，并通过western blot和RT-qPCR验证。

验证PDCL3敲低对GA-MSCs功能的影响

确定PDCL3是否调控GA-MSCs的周细胞分化和血管生成拟态。

用shPDCL3慢病毒敲低GA-MSCs中PDCL3表达，检测PDCL3、VEGFR-2和周细胞标记物的表达，并进行试管形成实验。

体内验证PDCL3对肿瘤生长和血管生成的影响

评估PDCL3在体内对胶质瘤进展和血管生成的作用。

将shPDCL3-MSC或NC-MSC与GSCs共植入裸鼠颅内，监测肿瘤体积，并通过免疫组化和免疫荧光检测CD31和α-SMA表达。

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养	DMEM培养基	Hyclone	SH30243.01
胎牛血清	Vivacell	C04001-500
青霉素-链霉素溶液，100X	Biosharp	BL505A
Accutase	Stemcell	07922
DMEM/F12培养基	Hyclone	SH30023.01
B27添加剂	Gibco	17504044
N2添加剂	Gibco	17502048
成纤维细胞生长因子2	Gibco	GMP100-18B-1MG
表皮生长因子	Gibco	GMP100-15-500UG
层粘连蛋白	Gibco	23017015
基质胶	Corning	354234
药物处理	人VEGF121重组蛋白	Proteintech	HZ-1204
Western blot	RIPA裂解液	Servicebio	G2002-100ML
BCA蛋白定量试剂盒	Servicebio	G2026-200T
PDCL3兔多克隆抗体	Invitrogen/Thermo Fisher	PA5-113381
VEGF受体2兔单克隆抗体	Abcam	ab315238
VEGF受体2兔多克隆抗体	Abcam	ab2349
α-平滑肌肌动蛋白小鼠单克隆抗体	Abcam	ab7817
结蛋白兔单克隆抗体	Abcam	ab32362
HRP标记的山羊抗兔IgG	Servicebio	GB23303
免疫沉淀	BeyoMag™蛋白A+G磁珠	Beyotime	P2108
RT-qPCR	Trizol试剂	Takara	9108
逆转录试剂盒	Takara	RR036A
TB Green Premix Ex Taq II	Takara	RR820A
流式分析	CD105单克隆抗体（APC）	eBioscience/Thermo Fisher	17-1057-42
CD90单克隆抗体（PerCP-Cyanine5.5）	eBioscience/Thermo Fisher	45-0909-42
CD73单克隆抗体（APC-eFluor780）	eBioscience/Thermo Fisher	47-0739-42
CD44单克隆抗体（FITC）	eBioscience/Thermo Fisher	11-0441-86
免疫组化/免疫荧光	CD31兔单克隆抗体	Abclonal	A19014
免疫荧光	CD133兔多克隆抗体	Proteintech	18470-1-AP
Nestin兔多克隆抗体	Proteintech	19483-1-AP
iF488-酪胺信号放大试剂	Servicebio	G1231-25UL
iF555-酪胺信号放大试剂	Servicebio	G1233-25UL
细胞分离	含酚红无EDTA胰酶溶液	Beyotime	C0207
70微米尼龙网	Falcon/Corning	352340/431751
红细胞裂解液	Servicebio	G2015-500ML
淋巴细胞分离液	Servicebio	G2097-100ML
基因微阵列	人类基因表达芯片	Affymetrix	902923
Agilent RNA 6000纳米试剂盒	Agilent	5067-1511
基因芯片WT PLUS试剂盒	Thermo Fisher	902280
基因芯片杂交洗涤染色试剂盒	Thermo Fisher	900720
动物实验	汉密尔顿注射器	Hamilton Company	--
生物发光成像系统	Bruker Corporation	--
组织学染色	DAB显色液	Servicebio	--

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养

DMEM培养基

Hyclone

SH30243.01

胎牛血清

Vivacell

C04001-500

青霉素-链霉素溶液，100X

Biosharp

BL505A

Accutase

Stemcell

07922

DMEM/F12培养基

Hyclone

SH30023.01

B27添加剂

Gibco

17504044

N2添加剂

Gibco

17502048

成纤维细胞生长因子2

Gibco

GMP100-18B-1MG

表皮生长因子

Gibco

GMP100-15-500UG

层粘连蛋白

Gibco

23017015

基质胶

Corning

354234

药物处理

人VEGF121重组蛋白

Proteintech

HZ-1204

Western blot

RIPA裂解液

Servicebio

G2002-100ML

BCA蛋白定量试剂盒

Servicebio

G2026-200T

PDCL3兔多克隆抗体

Invitrogen/Thermo Fisher

PA5-113381

VEGF受体2兔单克隆抗体

Abcam

ab315238

VEGF受体2兔多克隆抗体

Abcam

ab2349

α-平滑肌肌动蛋白小鼠单克隆抗体

Abcam

ab7817

结蛋白兔单克隆抗体

Abcam

ab32362

HRP标记的山羊抗兔IgG

Servicebio

GB23303

免疫沉淀

BeyoMag™蛋白A+G磁珠

Beyotime

P2108

RT-qPCR

Trizol试剂

Takara

9108

逆转录试剂盒

Takara

RR036A

TB Green Premix Ex Taq II

Takara

RR820A

流式分析

CD105单克隆抗体（APC）

eBioscience/Thermo Fisher

17-1057-42

CD90单克隆抗体（PerCP-Cyanine5.5）

eBioscience/Thermo Fisher

45-0909-42

CD73单克隆抗体（APC-eFluor780）

eBioscience/Thermo Fisher

47-0739-42

CD44单克隆抗体（FITC）

eBioscience/Thermo Fisher

11-0441-86

免疫组化/免疫荧光

CD31兔单克隆抗体

Abclonal

A19014

免疫荧光

CD133兔多克隆抗体

Proteintech

18470-1-AP

Nestin兔多克隆抗体

Proteintech

19483-1-AP

iF488-酪胺信号放大试剂

Servicebio

G1231-25UL

iF555-酪胺信号放大试剂

Servicebio

G1233-25UL

细胞分离

含酚红无EDTA胰酶溶液

Beyotime

C0207

70微米尼龙网

Falcon/Corning

352340/431751

红细胞裂解液

Servicebio

G2015-500ML

淋巴细胞分离液

Servicebio

G2097-100ML

基因微阵列

人类基因表达芯片

Affymetrix

902923

Agilent RNA 6000纳米试剂盒

Agilent

5067-1511

基因芯片WT PLUS试剂盒

Thermo Fisher

902280

基因芯片杂交洗涤染色试剂盒

Thermo Fisher

900720

动物实验

汉密尔顿注射器

Hamilton Company

生物发光成像系统

Bruker Corporation

组织学染色

DAB显色液

Servicebio

环节	核对要点
GA-MSCs分离和培养	组织来源、消化时间、离心条件、培养条件和传代方法阅读提示：STAR★Methods: Isolation and culture of human GA-MSCs
GSCs分离和培养	组织消化、培养基成分（B27、N2、FGF2、EGF浓度）和培养条件阅读提示：STAR★Methods: Isolation and culture of human glioma stem cells
条件培养基收集	细胞密度、血清饥饿时间、离心速度和时间阅读提示：STAR★Methods: Collection of glioma stem cells and U87 MG cells conditioned medium
慢病毒转染	慢病毒载体类型、转染时细胞密度、病毒体积、观察时间阅读提示：STAR★Methods: Lentivirus and transfection
Western blot	抗体稀释比例、孵育条件、蛋白提取和定量方法阅读提示：STAR★Methods: Western blot and co-immunoprecipitation (Co-IP) assays
RT-qPCR	RNA提取方法、逆转录试剂盒、PCR系统、内参基因阅读提示：STAR★Methods: RT-qPCR
试管形成实验	Matrigel包被条件、细胞接种密度、培养基条件、观察时间阅读提示：STAR★Methods: Tube formation
体内实验	小鼠品系、年龄、性别、细胞注射数量、注射坐标、监测方法阅读提示：STAR★Methods: Intracranial xenograft model

环节

核对要点

GA-MSCs分离和培养

组织来源、消化时间、离心条件、培养条件和传代方法

阅读提示：STAR★Methods: Isolation and culture of human GA-MSCs

GSCs分离和培养

组织消化、培养基成分（B27、N2、FGF2、EGF浓度）和培养条件

阅读提示：STAR★Methods: Isolation and culture of human glioma stem cells

条件培养基收集

细胞密度、血清饥饿时间、离心速度和时间

阅读提示：STAR★Methods: Collection of glioma stem cells and U87 MG cells conditioned medium

慢病毒转染

慢病毒载体类型、转染时细胞密度、病毒体积、观察时间

阅读提示：STAR★Methods: Lentivirus and transfection

Western blot

抗体稀释比例、孵育条件、蛋白提取和定量方法

阅读提示：STAR★Methods: Western blot and co-immunoprecipitation (Co-IP) assays

RT-qPCR

RNA提取方法、逆转录试剂盒、PCR系统、内参基因

阅读提示：STAR★Methods: RT-qPCR

试管形成实验

Matrigel包被条件、细胞接种密度、培养基条件、观察时间

阅读提示：STAR★Methods: Tube formation

体内实验

小鼠品系、年龄、性别、细胞注射数量、注射坐标、监测方法

阅读提示：STAR★Methods: Intracranial xenograft model

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