基因组挖掘与基因簇鉴定
鉴定Talaromyces adpressus中负责合成sordarin的生物合成基因簇
使用SdnA蛋白序列作为探针，在T. adpressus基因组中搜索同源蛋白，鉴定出tdn基因簇，并通过生物信息学分析和蛋白BLAST与sdn基因簇进行比对。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过基因组挖掘在真菌Talaromyces adpressus中发现sordarin的新生物合成基因簇
Uncovering a novel biosynthetic gene cluster for sordarin through genome mining in the fungus Talaromyces adpressus.
实验完整度
高包含基因簇鉴定、异源表达、结构解析、细胞活性实验和分子对接等多个独立证据层级，且包含功能验证和机制探索。
主要模型
米曲霉异源表达系统（AO-tdnAC和AO-tdnACBEFH） 人癌细胞系HCT-116、A549、HepG2、MCF-7、SW1990
重点核对
异源表达宿主为A. oryzae NSAR1，使用pAdeA2和pUARA2质粒 化合物1-4的分离纯化使用正相硅胶柱色谱，石油醚和乙酸乙酯洗脱 细胞活力实验：化合物浓度5-40 µM，处理48小时，CCK-8检测 细胞凋亡实验：化合物浓度5-40 µM，处理6小时，Annexin V-FITC染色 qRT-PCR检测BCL-2、cyclin D1和BAX基因表达，以β-actin为内参
摘要
为了探索真菌Talaromyces adpressus中二萜类化合物的化学和生物多样性，通过利用基因组挖掘方法，发现了一个先前未知的sordarin（一种著名的真菌抗生素）生物合成基因簇（BGC，tdn）。在米曲霉（Aspergillus oryzae）中异源表达tdn的关键基因，导致确定了一个新的二萜类化合物cycloaraneosene-9-ol-8-one（4）和三个已知的二萜类化合物cycloaraneosene（1）、cycloaraneosene-9-ol（2）、cycloaraneosene-8,9-diol（3）。通过详细分析1D和2D NMR、GCMS、HRESIMS、IR数据，并与报道的数据进行比较，很好地阐明了1-4的结构。从结构上看，化合物1-4属于具有经典三环5/8/5环系的fusicoccane二萜类化合物，它们参与sordarin的生物合成。化合物4可能是sordarin生物合成途径中C8-C9键断裂的Baeyer-Villiger样反应的关键前体。此外，对所有分离物进行了生物活性评估，化合物3和4对人癌细胞系表现出抑制活性，IC50值范围为7.8至32.4 µM。3和4促进HCT-116和HepG2细胞的细胞凋亡，并抑制HepG2细胞的迁移。同样，3和4还降低细胞增殖相关分子BCL-2和cyclin D1的基因表达，同时增加细胞凋亡相关基因BAX的表达。靶点预测和分子对接表明，化合物4对DBL表现出更强的亲和力，表明其具有极好的结合潜力。这一发现将丰富具有三环5/8/5环系的二萜类化合物的结构和生物活性，最重要的是，将为sordarins的合成生物学研究提供新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索真菌Talaromyces adpressus中二萜类化合物的化学和生物多样性，特别是sordarin的生物合成途径。
- 核心机制
- 新化合物4可能是sordarin生物合成途径中C8-C9键断裂的Baeyer-Villiger样反应的关键前体。
- 主要证据
- 通过基因组挖掘发现tdn基因簇，并在A. oryzae中异源表达tdnAC和tdnACBEFH，分离鉴定了化合物1-4；化合物3和4对多种人癌细胞系具有细胞毒性，并通过促进凋亡、抑制迁移和调节凋亡相关基因表达发挥作用。
- 研究意义
- 丰富具有三环5/8/5环系的二萜类化合物的结构和生物活性，为sordarins的合成生物学研究提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
异源表达质粒构建
构建用于在A. oryzae中异源表达tdn基因的质粒
从T. adpressus基因组DNA中扩增tdnA、tdnB、tdnC、tdnE、tdnF和tdnH基因，通过Gibson assembly构建pAdeA2-tdnAC和pUARA2-tdnBEFH质粒。
A. oryzae转化与发酵
获得表达tdn基因的转化子并产生目标化合物
采用原生质体-聚乙二醇法转化A. oryzae，构建AO-tdnAC和AO-tdnACBEFH转化子，在MPY液体培养基中发酵，30°C、220 rpm培养1周。
化合物分离纯化
从发酵产物中分离纯化目标化合物1-4
发酵液用乙酸乙酯萃取，浓缩后经正相硅胶柱色谱分离，AO-tdnAC产物用石油醚洗脱得到化合物1，AO-tdnACBEFH产物用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到化合物2-4。
结构鉴定
确定化合物1-4的化学结构
通过HRESIMS、1D和2D NMR、IR、UV等谱学数据分析，并与文献数据比较，确定化合物1为cycloaraneosene，2为cycloaraneosene-9-ol，3为cycloaraneosene-8,9-diol，4为新化合物cycloaraneosene-9-ol-8-one。
细胞毒性评估
评估化合物1-4对人癌细胞系的细胞毒性
采用CCK-8法检测化合物1-4对HCT-116、A549、HepG2、MCF-7和SW1990细胞系的细胞活力，计算IC50值。
细胞凋亡检测
评估化合物3和4对癌细胞凋亡的影响
使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒，通过流式细胞术检测化合物3和4处理后HCT-116和HepG2细胞的凋亡率。
细胞迁移实验
评估化合物3和4对HepG2细胞迁移能力的影响
采用Transwell实验，将经化合物3和4处理48小时的HepG2细胞接种于Transwell小室，培养8小时后染色计数迁移细胞。
qRT-PCR检测基因表达
检测化合物3和4对凋亡和增殖相关基因表达的影响
提取处理后的HepG2细胞总RNA，反转录为cDNA，通过qRT-PCR检测BCL-2、cyclin D1和BAX的mRNA表达水平，以β-actin为内参。
分子对接
预测化合物3和4与潜在靶标DBL的结合模式
使用YASARA进行分子对接，将化合物3和4与DBL蛋白（PDB ID: 1BY1）进行对接，评估结合亲和力并分析关键残基相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 结构鉴定 | PerkinElmer 341 | PerkinElmer | -- |
| Varian Cary 50 | Varian | -- | |
| Bruker Vertex 70 | Bruker | -- | |
| JASCO-810 | JASCO | -- | |
| Thermo Fisher LC-LTQ-Orbitrap XL | Thermo Fisher | -- | |
| Bruker AM-400 | Bruker | -- | |
| 分离纯化 | 硅胶 | Qingdao Marine Chemical, Inc. | -- |
| Lichroprep RP-C18凝胶 | Merck | -- | |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | -- | |
| 重组DNA | KOD-Fx-Neo | TOYOBO | -- |
| NEBuilder HiFi DNA组装预混液 | New England BioLabs | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒8（CCK-8） | Dojindo Laboratories | -- |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | KeyGEN | -- |
| qRT-PCR | 转录试剂盒 | Vazyme Biotech Co.,Ltd | -- |
| SYBR Green qPCR预混液 | Vazyme Biotech Co.,Ltd | -- | |
| ABI QuantStudio 5 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Transwell实验 | BD Falcon细胞培养小室 | BD Biosciences | -- |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| Olympus荧光显微镜 | Olympus | -- | |
| 分子对接 | YASARA | -- | -- |
| PyMOL | -- | -- | |
| 统计软件 | Prism | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 异源表达 | 宿主菌株A. oryzae NSAR1；质粒pAdeA2-tdnAC和pUARA2-tdnBEFH；转化方法为原生质体-聚乙二醇法 阅读提示：Methods: Preparation of expression plasmids; Transformation of A. oryzae |
| 发酵与提取 | MPY液体培养基组成（3%麦芽糖，1% hipolypeptone，0.5%酵母提取物，10 mg腺嘌呤）；培养条件：30°C，220 rpm，1周；发酵体积2-5 L；乙酸乙酯萃取5次 阅读提示：Methods: Fermentation, extraction, and purification |
| 化合物分离 | 正相硅胶柱色谱；AO-tdnAC产物用石油醚洗脱得1；AO-tdnACBEFH产物用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得2-4 阅读提示：Methods: Fermentation, extraction, and purification |
| 细胞活力检测 | 细胞系：HCT-116、A549、HepG2、MCF-7、SW1990；化合物浓度5-40 µM；处理48小时；CCK-8检测；阳性对照顺铂；三次重复 阅读提示：Methods: Cell culture, administration and detection |
| 细胞凋亡检测 | 细胞系：HepG2和HCT-116；化合物浓度5-40 µM；处理6小时；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 阅读提示：Methods: Cell culture, administration and detection |
| 细胞迁移实验 | 细胞系：HepG2；处理48小时；Transwell小室（8 μm）；培养8小时；结晶紫染色 阅读提示：Methods: Transwell assay |
| qRT-PCR | 基因：BCL-2、cyclin D1、BAX；内参β-actin；引物序列见表S3；两步法PCR程序 阅读提示：Methods: Quantitative real time PCR (qRT-PCR) tests; 补充材料表S3 |
| 分子对接 | 蛋白结构：PDB ID 1BY1；软件YASARA v20.10.4；力场AMBER14和GAFF；电荷RESP HF/6-31G*；Na+中和 阅读提示：Methods: Molecular docking |