鉴定circATP5C1特征
验证circATP5C1的环状结构、稳定性及亚细胞定位
通过GEO微阵列数据分析筛选差异circRNA，Sanger测序验证backsplice位点，RT-qPCR检测表达，放线菌素D和RNase R处理评估稳定性，核质分离和FISH确定定位。
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circATP5C1通过结合IGF2BP2调节CSF-1分泌促进三阴性乳腺癌进展
CircATP5C1 promotes triple-negative breast cancer progression by binding IGF2BP2 to modulate CSF-1 secretion.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、RNA-seq、RNA pull-down、RIP、FISH、体内异种移植模型及患者组织芯片分析，验证了circATP5C1/IGF2BP2/CSF-1机制通路。
主要模型
TNBC细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549、HS-578T 正常乳腺上皮细胞MCF-10A BALB/c裸鼠皮下异种移植模型 127例乳腺癌组织微阵列（含25例TNBC）
重点核对
细胞系：MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549、HS-578T，均经STR鉴定 circATP5C1过表达质粒（pCD5-ciR载体）和siRNA靶向backsplice位点 rhCSF-1处理浓度：25 ng/ml，处理24小时 裸鼠皮下注射3×10^6 MDA-MB-231细胞，4周后取材 统计方法：t检验、ANOVA、Fisher精确检验、卡方检验，P<0.05
摘要
三阴性乳腺癌（TNBC）是女性常见的恶性肿瘤，严重威胁全球女性健康。如今，环状RNA（circRNAs）因其在人类癌症（包括TNBC）中的功能而引起我们的兴趣。然而，大多数circRNAs在TNBC进展中的机制仍不清楚。我们发现了一种新的circRNA，命名为circATP5C1，其在TNBC中的功能仍未阐明。使用组织微阵列分析circATP5C1表达与TNBC患者预后之间的关联。进行了功能获得和功能丧失实验，以验证circATP5C1在不同TNBC细胞系中的生物学功能。进行了RNA-seq分析，以找出circATP5C1调控的靶基因。使用RNA pull-down实验和质谱法选择与circATP5C1相关的蛋白质。补充了RNA FISH-免疫荧光和RNA免疫沉淀（RIP）以验证circATP5C1与其结合蛋白之间的相互作用。circATP5C1被确定对TNBC患者的预后具有预测功能。circATP5C1促进了TNBC细胞的进展。机制上，集落刺激因子1（CSF-1）是circATP5C1调控的重要下游基因。CSF-1表达水平的改变被验证是由于circATP5C1与胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IGF2BP2）之间的相互作用。救援实验表明，circATP5C1部分通过结合IGF2BP2增加CSF-1的分泌来加速TNBC的进展。本研究揭示了circATP5C1/IGF2BP2/CSF-1通路调控TNBC进展的新机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circATP5C1在TNBC进展中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- circATP5C1通过与IGF2BP2蛋白结合，增强CSF-1 mRNA的稳定性，从而促进CSF-1分泌，激活下游信号，最终促进TNBC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT。
- 主要证据
- 基于RNA-seq、RNA pull-down、RIP、FISH等实验证实circATP5C1与IGF2BP2相互作用，并验证IGF2BP2直接结合CSF-1 mRNA；功能实验、救援实验及体内实验证实circATP5C1/IGF2BP2/CSF-1轴促进TNBC进展。
- 研究意义
- 揭示circATP5C1/IGF2BP2/CSF-1通路为TNBC预后判断和治疗提供新视角，circATP5C1可能成为TNBC的生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
临床相关性分析
评估circATP5C1表达与乳腺癌患者预后的关系
使用组织微阵列进行FISH检测127例乳腺癌组织（含25例TNBC）中circATP5C1表达，结合临床病理特征和随访数据进行Kaplan-Meier生存分析和Cox回归分析。
验证circATP5C1对TNBC细胞功能的影响
确定circATP5C1对TNBC细胞增殖、迁移和侵袭的影响
在低表达细胞中过表达circATP5C1，在高表达细胞中敲低circATP5C1，通过CCK8、克隆形成、Transwell和伤口愈合实验检测细胞功能变化。
体内异种移植实验
验证circATP5C1对肿瘤生长的影响
将sh-NC或sh-circATP5C1慢病毒感染的MDA-MB-231细胞皮下注射到裸鼠，监测肿瘤生长，4周后取材称重并进行Ki-67免疫组化染色。
RNA-seq筛选下游靶基因
鉴定circATP5C1调控的下游基因和通路
对敲低circATP5C1的MDA-MB-231细胞进行mRNA测序，分析差异表达基因，并通过GO和KEGG富集分析，选择候选基因用RT-qPCR验证，发现CSF-1为关键下游基因。
验证CSF-1对细胞功能的影响
确定CSF-1是否介导circATP5C1的功能
通过ELISA检测CSF-1分泌，Western blot检测EMT标志物，并用rhCSF-1进行救援实验，观察细胞增殖、迁移、侵袭及EMT标志物的变化。
研究circATP5C1与IGF2BP2的相互作用
探索circATP5C1结合蛋白及其对CSF-1的调控机制
通过RNA pull-down联合质谱鉴定IGF2BP2为结合蛋白，通过Western blot、FISH和RIP验证相互作用，并通过MeRIP检测CSF-1 mRNA的m6A修饰，放线菌素D实验检测mRNA稳定性。
体外救援实验验证机制
验证circATP5C1通过IGF2BP2/CSF-1轴促进TNBC进展
在circATP5C1过表达细胞中敲低IGF2BP2，检测细胞增殖、迁移、侵袭及EMT标志物变化，确认IGF2BP2敲低可逆转circATP5C1的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织芯片 | 乳腺癌组织芯片 | Outdo Biotech Company | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | GIBCO | -- |
| Leibovitz L-15培养基 | GIBCO | -- | |
| RPMI1640培养基 | GIBCO | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 马血清 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 非必需氨基酸 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 重组人集落刺激因子1 | MedChemExpress | -- |
| 转染 | pCD5-ciR载体 | Geneseed Biotech Co. | -- |
| PolyFect转染试剂 | Promega | -- | |
| HiperFect转染试剂 | Promega | -- | |
| DNA提取 | 基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA酶处理 | RNase R | Epicenter | -- |
| 核质分离 | PARIS™试剂盒 | Life Technologies | -- |
| 逆转录 | GoScript逆转录系统 | Promega | -- |
| qPCR | GoTaq qPCR预混液 | Promega | -- |
| PCR | GoTaq Green预混液 | Promega | -- |
| 凝胶电泳 | Safe Green核酸染料 | Monad | -- |
| 对照处理 | 二甲基亚砜 | Solarbio | -- |
| FISH | Cy3标记的circATP5C1探针 | Guangzhou Geneseed Biotech Co., Ltd. | -- |
| 荧光成像 | LSM 900共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂盒 | MedChemExpress | -- |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 侵袭实验 | Matrigel基质胶 | BD biosciences | -- |
| 显微镜 | DFC295显微镜 | Leica | -- |
| ELISA | 人M-CSF ELISA试剂盒 | Proteintech | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 封闭液 | Seven | -- | |
| E-钙黏蛋白抗体 | proteintech | -- | |
| N-钙黏蛋白抗体 | proteintech | -- | |
| 波形蛋白抗体 | proteintech | -- | |
| IGF2BP2抗体 | proteintech | -- | |
| GAPDH抗体 | proteintech | -- | |
| 电化学发光检测试剂盒 | Solarbio | -- | |
| RNA FISH-免疫荧光 | IGF2BP2抗体 | proteintech | -- |
| Alexa Fluor™ 488偶联二抗 | proteintech | -- | |
| RNA pull-down | Pierce™磁珠RNA-蛋白Pull-Down试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 银染 | 快速银染试剂盒 | Beyotime | -- |
| RIP/MeRIP | RIP试剂盒 | Guangzhou Geneseed Biotech Co., Ltd. | -- |
| 抗m6A抗体 | proteintech | -- | |
| 对照IgG | proteintech | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Hfk (Beijing) Bioscience Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源、培养基、血清浓度、转染试剂和转染时间 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture, drug treatment and transfection |
| circATP5C1敲低与过表达 | siRNA序列及转染效率验证，过表达质粒构建及效率验证 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture, drug treatment and transfection; Results: CircATP5C1 promotes TNBC cells progression |
| RNA-seq | 测序平台、差异表达阈值、重复数 阅读提示：Materials and Methods: mRNA sequencing |
| RNA pull-down和质谱 | 探针序列、细胞裂解条件、银染和质谱分析步骤 阅读提示：Materials and Methods: RNA pull-down and silver staining assays |
| RIP/MeRIP | 抗体种类、细胞量、免疫沉淀条件 阅读提示：Materials and Methods: RNA immunoprecipitation (RIP) and methylated RNA immunoprecipitation (MeRIP) assays |
| 体内动物实验 | 动物品系、周龄、性别、体重、细胞注射数量和部位、观察时间、样本量 阅读提示：Materials and Methods: In vivo studies |