细胞培养与SF3B4敲低
建立SF3B4低表达模型，以研究其对HCC细胞功能的影响。
使用siRNA（siSF3B4-2）转染Huh7细胞，敲低SF3B4表达，并通过RT-qPCR和Western blot验证敲低效率。
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SF3B4通过选择性剪接及与TRIM28和SETD5的相互作用调控肝细胞癌的增殖和凋亡
SF3B4 regulates proliferation and apoptosis in hepatocellular carcinoma via alternative splicing and interaction with TRIM28 and SETD5.
实验完整度
中包含体外细胞功能实验（增殖、凋亡）、RNA-seq和iRIP-seq等组学分析及qPCR验证，但缺乏体内动物模型实验，证据层级主要限于体外和生物信息学。
主要模型
Huh7细胞系（人肝癌细胞） K562和HepG2细胞（eCLIP-seq数据来源）
重点核对
细胞系：Huh7 siRNA靶向SF3B4（siSF3B4-2） 转染试剂：Lipofectamine RNAiMAX 检测时间：转染后48小时 抗体：SF3B4抗体（A17608，Abclonal；10482-1-AP，Proteintech）
摘要
背景：SF3B4编码U2型剪接体的核心亚基，与异常细胞生长和肿瘤发生有关。然而，其在肝细胞癌（HCC）中调控基因表达和选择性剪接的作用仍未得到充分理解。方法：在HCC细胞中下调SF3B4表达，随后进行高通量转录组测序以捕获SF3B4诱导的转录组变化。该方法有助于在转录和选择性剪接水平上鉴定HCC细胞中受SF3B4调控的潜在靶标。此外，通过iRIP-seq鉴定了Huh7细胞中SF3B4结合的RNA。随后对RNA-seq数据进行分析，以阐明SF3B4在HCC中影响基因表达和选择性剪接的分子机制。结果：SF3B4的下调促进了凋亡并抑制了细胞增殖。在RNA-seq数据中，受调控的选择性剪接事件（RASE）的数量显著多于差异表达基因（DEGs），这与SF3B4作为剪接因子调控大量前体mRNA剪接事件的作用一致。此外，共鉴定出252个SF3B4结合的常见RNA靶标。与RNA-seq数据的相关性分析提示，SF3B4可能结合TRIM28，可能调节其mRNA表达水平。此外，SF3B4可能通过与SETD5相互作用影响前体mRNA的选择性剪接。结论：SF3B4通过直接结合mRNA和与蛋白质相互作用，从而调控基因表达和选择性剪接，促进HCC进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SF3B4在肝细胞癌中如何通过调控基因表达和选择性剪接影响细胞增殖和凋亡？
- 核心机制
- SF3B4通过直接结合mRNA（如TRIM28）并与之相互作用，调控其表达；同时通过与其他蛋白（如SETD5）相互作用影响前体mRNA的选择性剪接，从而促进HCC进展。
- 主要证据
- 在Huh7细胞中敲低SF3B4后，RNA-seq和iRIP-seq数据揭示大量RASE和DEGs，且SF3B4直接结合TRIM28和SETD5的mRNA，并通过qPCR和RIP-qPCR验证。
- 研究意义
- SF3B4可能作为HCC诊断和治疗的潜在靶点，但其临床相关性仍需体内实验进一步验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞增殖和凋亡检测
评估SF3B4敲低对HCC细胞增殖和凋亡的影响。
使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒通过流式细胞术检测细胞凋亡。
转录组测序（RNA-seq）
鉴定SF3B4敲低后差异表达基因和受调控的选择性剪接事件。
对siSF3B4和阴性对照处理的Huh7细胞进行RNA-seq，分析DEGs和RASE。
iRIP-seq实验
鉴定SF3B4结合的RNA靶标。
使用SF3B4抗体进行RNA免疫沉淀，然后进行高通量测序，鉴定SF3B4结合的RNA区域。
功能富集分析
分析SF3B4靶基因和RASE相关基因的生物学功能和通路。
使用GO和KEGG富集分析，评估DEGs和RASGs的功能类别。
RT-qPCR验证
验证RNA-seq和iRIP-seq结果中关键基因的表达和剪接变化。
使用RT-qPCR验证TRIM28和SETD5的表达及剪接变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 基因敲低 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取与RT-qPCR | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RT-qPCR | SYBR Green预混液 | YEASEN | -- |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| SF3B4抗体 | Abclonal | A17608 | |
| GAPDH抗体 | AtaGenix | ATPA00013Rb | |
| HRP标记二抗 | Abcam | -- | |
| 增强化学发光试剂 | Bio-Rad | 170506 | |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | YEASEN | -- |
| iRIP-seq | RNA酶抑制剂 | Takara | 2311 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Bimake | B14001 | |
| RQ1无RNase的DNase | Promega | -- | |
| 微球菌核酸酶 | Thermo Scientific | -- | |
| 核糖核酸酶T1 | Thermo Scientific | 60140-101 | |
| SF3B4抗体 | Proteintech | 10482-1-AP | |
| IgG抗体 | -- | AC005 | |
| 蛋白A/G磁珠 | Thermo Scientific | 10009D | |
| 蛋白酶K | Sangon Biotech | A600451 | |
| 文库构建 | KAPA RNA超制备试剂盒 | KAPA | KK8541 |
| RT-qPCR | M-MLV逆转录酶 | Vazyme | R021-01 |
| Hieff qPCR SYBR Green预混液 | YEASEN | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与敲低 | Huh7细胞系来源、培养条件（DMEM+10%FBS+100 µg/mL链霉素+100 U/mL青霉素）、siRNA转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX）、转染后48小时收获 阅读提示：Methods: Cell culture and transfections |
| 增殖与凋亡检测 | CCK-8实验的细胞接种密度（6000细胞/孔）、检测时间点（24/48/72小时）、凋亡检测的染色剂量（5 µL Annexin V-FITC, 10 µL PI） 阅读提示：Methods: Cell proliferation assay 和 Annexin V apoptosis assay |
| RNA-seq和iRIP-seq | iRIP-seq抗体（SF3B4抗体10482-1-AP）、RNA酶抑制剂浓度（400 U/mL）、MNase和RNase T1处理、免疫沉淀用磁珠（protein A/G Dynabeads） 阅读提示：Methods: Co-immunoprecipitation and library preparation |
| 生信分析 | 比对工具HISAT2、peak calling软件（Piranha和ABLIRC）、ENCODE eCLIP-seq数据（ENCSR267OLV和ENCSR279UJF）、KOBAS 2.0进行GO/KEGG富集分析 阅读提示：Methods: Retrieval and process of public data 和 Data analysis |