NSUN4 Facilitates the Activity of Oncogenic Protein CDC20 to Promote NSCLC Development by Mediating m5C Modification of CDC20 mRNA.
包含体外细胞功能实验（增殖、凋亡、迁移、侵袭、干性）、机制实验（RIP、mRNA稳定性）、体内皮下异种移植模型及人样本验证。
A549人肺腺癌细胞系 SK-MES-1人肺鳞状细胞癌细胞系 BALB/c裸鼠皮下异种移植模型 人NSCLC肿瘤组织及配对癌旁组织
NSUN4敲低或过表达后CDC20 mRNA和蛋白表达变化 NSUN4与CDC20 mRNA的结合及m5C修饰水平 放线菌素D处理后CDC20 mRNA半衰期 CDC20敲低对NSUN4驱动的细胞表型的影响 sh-NSUN4#2慢病毒感染A549细胞皮下成瘤能力
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估NSUN4和CDC20在NSCLC肿瘤和细胞系中的表达水平及其相关性。
利用TIMER和UALCAN数据库分析NSUN4表达；通过定量PCR检测53对NSCLC肿瘤及配对正常组织中NSUN4和CDC20 mRNA水平；Western blot检测4对肿瘤组织中NSUN4和CDC20蛋白表达；在NSCLC细胞系（A549、SK-MES-1等）和正常支气管上皮BEAS-2B细胞中检测蛋白水平；使用LinkedOmics数据库分析表达相关性。
验证NSUN4对NSCLC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和干性的影响。
使用sh-NSUN4#1或sh-NSUN4#2敲低NSUN4，或使用NSUN4表达构建体过表达NSUN4，通过集落形成、流式细胞术、transwell和成球实验检测细胞表型；Western blot检测干性相关蛋白SOX2、CD133、KLF4表达。
探究NSUN4是否通过m5C修饰影响CDC20 mRNA的稳定性，并验证ALYREF的依赖作用。
通过RIP实验检测NSUN4与CDC20 mRNA的结合及m5C修饰水平；使用放线菌素D处理检测CDC20 mRNA半衰期；通过ALYREF RIP实验和ALYREF过表达实验验证ALYREF的依赖作用。
验证CDC20是否是NSUN4促进NSCLC恶性表型的下游效应因子。
在NSUN4过表达的A549和SK-MES-1细胞中敲低CDC20，检测集落形成、凋亡、迁移、侵袭和干性变化。
评估NSUN4敲低对A549皮下肿瘤生长的影响。
将感染sh-NSUN4#2慢病毒或对照的A549细胞皮下注射到BALB/c裸鼠，监测肿瘤体积和重量，并通过Western blot和免疫组化检测蛋白表达。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Cell Application | -- |
| RPMI-1640培养基 | Cell Application | -- | |
| MEM培养基 | Cell Application | -- | |
| 胎牛血清 | Nichirei Bioscience | -- | |
| 基因转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA提取和RT-qPCR | RNA纯化试剂盒 | Norgen Biotek Corporation | -- |
| GoScript反转录系统 | Promega | -- | |
| Thunderbird SYBR qPCR预混液 | Toyobo | -- | |
| Western blot | EZ-ECL化学发光试剂盒 | Biological Industries | -- |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC和PI凋亡检测试剂盒 | Vazyme Biotech | -- |
| 侵袭实验 | Matrigel侵袭小室 | BD Biosciences | -- |
| 迁移实验 | 24孔Transwell迁移小室 | BD Biosciences | -- |
| 成球实验 | 96孔透明圆底超低吸附板 | Corning | -- |
| RNA免疫沉淀 | BeyoRIP RIP检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 蛋白A/G琼脂糖 | -- | -- | |
| 抗体验证 | 兔抗NSUN4多克隆抗体 | Proteintech | 29786-1-AP |
| 兔抗CDC20多克隆抗体 | Proteintech | 10252-1-AP | |
| 兔抗SOX2多克隆抗体 | Proteintech | 11064-1-AP | |
| 兔抗CD133单克隆抗体 | Abcam | ab222782 | |
| 兔抗KLF4多克隆抗体 | Proteintech | 11880-1-AP | |
| 小鼠抗β-actin单克隆抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| RNA免疫沉淀 | 兔抗NSUN4多克隆抗体 | ABclonal | A14983 |
| 小鼠抗m5C单克隆抗体 | Diagenode | C15200081 | |
| 兔抗ALYREF多克隆抗体 | Proteintech | 16690-1-AP | |
| 兔抗IgG多克隆抗体 | Proteintech | 30000-0-AP | |
| 动物实验 | 聚凝胺 | Beyotime | -- |
| 嘌呤霉素 | Beyotime | -- | |
| 细胞培养 | 结晶紫 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | NSCLC肿瘤及配对癌旁组织来源（53例），患者知情同意，伦理批准。 阅读提示：Methods 2.2 Human Clinical Specimens |
| 细胞培养 | 细胞系和培养基（A549和BEAS-2B用DMEM，H460、H1299、H2170用RPMI-1640，SK-MES-1用MEM），补充10% FBS和1%链霉素/青霉素，培养条件：37°C，5% CO2。 阅读提示：Methods 2.3 Cell Lines and Culture Method |
| 基因敲低和过表达 | sh-NSUN4#1、sh-NSUN4#2、sh-CDC20、NSUN4表达构建体、ALYREF过表达构建体，使用Lipofectamine 3000转染。 阅读提示：Methods 2.4 Constructs and Transfection and Transduction of Cell Lines |
| 体外功能实验 | A549和SK-MES-1细胞，转染后24小时种板，集落形成实验10-14天，凋亡检测转染后72小时，迁移和侵袭实验孵育24小时，成球实验培养1周。 阅读提示：Methods 2.8-2.11; Figure legends 2 and 5 |
| mRNA稳定性检测 | Act D浓度50 μg/mL，处理0、2、4、8小时，检测CDC20 mRNA剩余量。 阅读提示：Methods 2.13 Actinomycin D Treatment |
| 体内异种移植实验 | BALB/c裸鼠，5-6周龄，雌性，皮下注射5×10^6 A549细胞（sh-ctrl或sh-NSUN4#2），每周测量肿瘤体积，5周后处死。 阅读提示：Methods 2.6 Subcutaneous Xenograft Studies; Figure legend 6 |
