生物信息学分析
评估TMC5在多种癌症及HCC中的表达水平及其与预后的相关性。
利用GENT2、GEPIA数据库分析TMC5 mRNA表达;使用Human Protein Atlas分析蛋白表达;基于TCGA-LIHC数据进行生存分析和Cox回归,构建列线图。
Transmembrane channel-like 5 drives hepatocellular carcinoma progression by regulating epithelial-mesenchymal transition.
包含生物信息学分析、临床样本IHC、体外细胞功能实验(增殖、迁移、侵袭)及体内小鼠原位瘤模型,并验证EMT标志物变化。
MHCC97-LM3细胞系 MHCC-97H细胞系 BALB/C裸鼠原位肝癌模型 HCC患者组织样本
TMC5在HCC组织和细胞中的表达水平需通过免疫组化和RT-qPCR验证 TMC5敲低和过表达效率需通过Western blot和qRT-PCR确认 体外功能实验采用的细胞系及其转移潜能(MHCC97-LM3高转移,MHCC-97H低转移) 体内实验所用细胞数量(1×10^6)和注射部位(左肝叶)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估TMC5在多种癌症及HCC中的表达水平及其与预后的相关性。
利用GENT2、GEPIA数据库分析TMC5 mRNA表达;使用Human Protein Atlas分析蛋白表达;基于TCGA-LIHC数据进行生存分析和Cox回归,构建列线图。
验证TMC5在HCC组织与癌旁组织中的表达差异。
对10对HCC肿瘤和癌旁组织进行免疫组化染色,比较TMC5表达水平。
检测TMC5在正常肝细胞和不同转移潜能HCC细胞系中的表达。
通过RT-qPCR检测LO2、MHCC-97H和MHCC97-LM3细胞中TMC5的表达。
评估TMC5对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
通过慢病毒介导的shRNA敲低MHCC97-LM3中的TMC5,过表达MHCC-97H中的TMC5,进行集落形成、Transwell侵袭和伤口愈合实验。
探究TMC5是否调控EMT相关蛋白的表达。
通过Western blot检测Snail、E-cadherin、N-cadherin、ZO-1的表达变化。
评估TMC5对HCC体内生长和转移的影响。
将稳定敲低或过表达TMC5的细胞注入裸鼠左肝叶,三周后通过活体成像和免疫组化分析肿瘤形成和EMT标志物。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | 10829 |
| 胎牛血清 | Gibco | 1902417 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668027 |
| RNA提取 | TriReagent总RNA提取试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| 逆转录 | FastKing逆转录试剂盒(含gDNase) | Tiangen Biotech | -- |
| qPCR | Taq Pro通用型SYBR qPCR预混液 | Vazyme Biotech Co., Ltd | -- |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| Western blot | 抗TMC5抗体 | Invitrogen | PA5-95696 |
| 抗Snail抗体 | Invitrogen | PA5-85493 | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | Invitrogen | MA5-12547 | |
| 抗N-钙黏蛋白抗体 | Invitrogen | PA5-19486 | |
| 抗ZO-1抗体 | Invitrogen | PA5-28858 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | ZSGB-bio | TA-09 | |
| IHC | 抗E-钙黏蛋白抗体 | Abcam | ab231303 |
| 抗N-钙黏蛋白抗体 | Abcam | ab98952 | |
| 抗ZO-1抗体 | Abcam | ab216880 | |
| 抗Snail抗体 | Invitrogen | PA5-23482 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系、培养基、血清浓度、培养条件 阅读提示:MATERIALS AND METHODS 中的 'Clinical specimens and cell line' |
| 转染 | shRNA和过表达慢病毒序列、转染试剂、感染复数 阅读提示:MATERIALS AND METHODS 中的 'Establishment of stable transfectant' |
| 体外功能实验 | 细胞接种密度、培养时间、Matrigel浓度 阅读提示:MATERIALS AND METHODS 中的 'Colony formation assay' 和 'Transwell invasion and wound healing assay' |
| 体内实验 | 小鼠品系、年龄、体重、细胞注射数量、时间、麻醉方法 阅读提示:MATERIALS AND METHODS 中的 'HCC mouse model and in vivo imaging analysis' |