化合物筛选
鉴定能挽救年龄相关可变剪接缺陷的化合物。
使用KH2235剪接报告线虫，筛选5623种化合物（包括4131种生物活性化合物和1492种FDA批准药物），通过测量GFP/mCherry比值筛选阳性化合物。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
多西氟尿苷通过细菌代谢促进宿主长寿
Doxifluridine promotes host longevity through bacterial metabolism.
实验完整度
高包含化合物筛选、RNA-seq、寿命及应激实验（体外细胞实验），并通过细菌基因敲除/回补、蛋白质组和代谢组进行功能与机制验证。
主要模型
秀丽隐杆线虫（C. elegans）野生型N2株 KH2235剪接报告基因线虫株 人类正常肝细胞系LO2 大肠杆菌（E. coli）菌株OP50、BW25113等
重点核对
药物浓度：多西氟尿苷40 μM和400 μM 细菌活性：活菌、冻干粉、热灭活、UV灭活 细菌基因型：upp、udp、adiY、lrp、gltB/gltD、adiA/speA敲除及回补 代谢物补充：尿苷、谷氨酰胺、亚油酸等的添加
摘要
衰老与可变剪接（AS）缺陷相关，这些缺陷对衰老相关疾病具有广泛影响。然而，哪些药物能够挽救与年龄相关的AS缺陷并延长寿命尚未得到系统探索。我们利用双荧光剪接报告系统在秀丽隐杆线虫中进行了大规模化合物筛选。在排名靠前的候选药物中，多西氟尿苷（一种氟嘧啶衍生物）能够挽救与年龄相关的AS缺陷并延长寿命。结合细菌DNA测序、蛋白质组学、代谢组学以及三方筛选系统，我们进一步揭示了细菌核糖核苷酸代谢在多西氟尿苷转化和功效中发挥重要作用。此外，多西氟尿苷增加细菌代谢产物（如亚油酸和胍丁胺）的产生，以延长宿主寿命。总之，我们的结果确定多西氟尿苷是挽救衰老相关AS缺陷和延长寿命的有效先导化合物，并阐明了药物通过药物、细菌和宿主之间复杂相互作用发挥功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些药物能够挽救与年龄相关的可变剪接缺陷并延长寿命，以及其作用机制是否依赖于细菌代谢。
- 核心机制
- 多西氟尿苷通过细菌核糖核苷酸代谢转化为活性代谢物（如FUMP/FUTP），并诱导细菌产生亚油酸和胍丁胺等代谢产物，从而延长宿主寿命。
- 主要证据
- 化合物筛选、RNA-seq、寿命实验、细菌基因敲除与回补实验、细菌蛋白质组和代谢组分析等。
- 研究意义
- 多西氟尿苷可作为挽救衰老相关剪接缺陷和延长寿命的潜在先导化合物，并揭示药物-细菌-宿主之间的复杂互作。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
寿命和健康span分析
评估候选化合物对线虫寿命和健康span的影响。
对筛选得到的阳性化合物进行寿命实验，并检测多西氟尿苷对热应激、病原菌感染和氧化应激的抵抗能力，以及线虫肌肉线粒体形态和肠道萎缩。
细菌依赖性验证
验证多西氟尿苷延长寿命的作用是否依赖活细菌。
使用冻干、热灭活、UV灭活的细菌及活菌，比较多西氟尿苷处理下的寿命变化，并检测多西氟尿苷对细菌增殖的影响及其是否为杀菌作用。
细菌核糖核苷酸代谢机制验证
确定细菌核糖核苷酸代谢在多西氟尿苷功效中的必要性。
对六种大肠杆菌菌株进行全基因组测序，分析SNP差异；在OP50中过表达yjjG，在BW25113中敲除upp、udp、tdk等基因并进行回补，检测寿命变化。
细菌代谢组学和蛋白质组学分析
鉴定多西氟尿苷诱导的细菌代谢变化及其对宿主寿命的影响。
对多西氟尿苷处理的大肠杆菌进行蛋白质组和代谢组分析，鉴定差异表达蛋白和代谢物，并通过敲除关键转录因子（adiY、lrp）和代谢酶（gltB/gltD、adiA/speA）验证其功能。
代谢物补充验证
验证多西氟尿苷诱导的细菌代谢产物（如亚油酸、胍丁胺）是否可直接延长寿命或改善剪接。
分别添加亚油酸、胍丁胺等代谢物，检测线虫寿命和剪接报告GFP/mCherry比值的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化合物筛选 | TargetMol Chemicals Inc. L5600 | TargetMol Chemicals Inc. | L5600 |
| Selleckchem L2000 | Selleckchem | L2000 | |
| 显微镜成像 | 左旋咪唑 | Sigma | L9756 |
| 细胞活力分析 | 细胞计数试剂盒-8 | Yeasen Biotechnology (Shanghai) | 40203ES76 |
| 细菌蛋白质组学 | 蛋白裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | ThermoFisher | A32963 | |
| Bradford检测试剂 | Bio-Rad | 5000205 | |
| TMT-10plex标记试剂 | Thermo Scientific | -- | |
| EASY-NLC 1000纳升级液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q Exactive Plus四极杆-Orbitrap质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 寿命实验 | 多西氟尿苷 | TOPSCIENCE | T1600 |
| 谷氨酰胺 | Solarbio | G8230 | |
| 尿苷 | TOPSCIENCE | T2221 | |
| 胸苷 | TOPSCIENCE | TWP2911 | |
| 麻醉椒苦素 | TOPSCIENCE | TQ0276 | |
| 脱氧肌苷 | TOPSCIENCE | T1709 | |
| 肌苷 | TOPSCIENCE | T0437 | |
| 亚油酸 | TOPSCIENCE | T4P2931 | |
| 应激实验 | 过氧化氢 | Sigma | BCCF3861 |
| 细菌基因组测序 | Qubit DNA检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| Qubit 3.0荧光计 | Invitrogen | -- | |
| NEB Next Ultra DNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | -- | |
| AMPure XP系统 | Beckman Coulter | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 线虫培养与同步化 | 培养温度、培养基（NGM）、食物菌株（OP50或BW25113）、同步化方法 阅读提示：Materials and methods: C. elegans strains and maintenance |
| 化合物筛选 | 筛选浓度（20 μM）、筛选时间（D7）、线虫株（KH2235） 阅读提示：Materials and methods: Drug screen; Figure 1A |
| 寿命实验 | 药物浓度（40 μM、400 μM）、细菌类型（活菌/灭活）、样本量（>60条/组）、重复次数（至少2次） 阅读提示：Materials and methods: Lifespan analysis; Figure legends 1I, 2A-2D |
| 细菌基因操作 | 菌株（OP50、BW25113）、基因敲除/过表达（upp、udp、adiY、lrp等）、筛选标记（卡那霉素、安普霉素） 阅读提示：Materials and methods: Bacterial strains and culture conditions, Bacterial mutant strains construction; Figure 3E-3L |
| 细菌蛋白质组学和代谢组学 | 处理浓度（400 μM）、培养时间（2天）、生物学重复（5-6次） 阅读提示：Materials and methods: Bacterial proteomics, Bacterial metabolomics |