细胞活性评估
确定伊沙利丁E对HUVEC是否存在细胞毒性
使用CCK-8试剂盒检测伊沙利丁E（6-96 μM）处理24小时后HUVEC的存活率。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
海洋化合物伊沙利丁E通过下调TLR4/NF-κB信号通路改善脂多糖诱导的血管内皮炎症
The Marine Compound Isaridin E Ameliorates Lipopolysaccharide-Induced Vascular Endothelial Inflammation via the Downregulation of the TLR4/NF-κB Signaling Pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HUVECs、THP-1单核细胞粘附、Western blot、RT-qPCR）和体内小鼠模型（主动脉及肺组织学、免疫组化、Evans Blue）多个证据层级，并含功能验证和机制验证（TLR4/NF-κB通路）。
主要模型
人脐静脉内皮细胞（HUVECs） THP-1单核细胞 LPS诱导的小鼠内毒素血症模型（C57BL/6小鼠）
重点核对
LPS浓度1 μg/mL，处理18小时（体外模型）；LPS剂量15 mg/kg腹腔注射，作用12小时（体内模型） 伊沙利丁E浓度（体外6–96 μM）及给药剂量（体内25、50、100 mg/kg，连续3天灌胃） 内皮细胞（HUVECs）培养条件（M199培养基、20%胎牛血清等） Western blot检测TLR4、IκBα、p-p65、TNF-α、ICAM-1的表达及其抗体来源 小鼠的分组及样本量（每组n=5或n=6）
摘要
伊沙利丁E是一种来源于海洋真菌Beauveria felina (SYSU-MS7908)的环状缩肽，已被证明具有多种生物活性。在本研究中，我们采用脂多糖刺激的人脐静脉内皮细胞和小鼠内毒素血症模型来研究其抗炎作用。我们的结果表明，伊沙利丁E以浓度依赖性方式抑制促炎细胞因子和粘附分子的表达，同时减少单核细胞与内皮细胞的粘附。此外，该化合物减弱了肺血管通透性过高和炎症细胞浸润，并保持了主动脉和肺组织的完整性。在分子水平上，发现伊沙利丁E下调TLR4表达，增加IκBα水平，并抑制LPS诱导的NF-κB p65磷酸化和核转位。总之，我们的研究结果表明，伊沙利丁E通过抑制TLR4/NF-κB信号轴在LPS诱导的内毒素血症中发挥强大的抗炎作用，使其成为血管炎症性疾病的有前途的治疗候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 伊沙利丁E是否能在体外和体内模型中减轻LPS诱导的血管内皮炎症，以及其潜在的分子机制？
- 核心机制
- 伊沙利丁E通过下调TLR4表达、增加IκBα水平，并抑制NF-κB p65的磷酸化和核转位，从而抑制TLR4/NF-κB信号通路，减少炎症介质产生。
- 主要证据
- 在LPS刺激的HUVECs中，伊沙利丁E抑制促炎细胞因子（TNF-α等）表达及单核细胞粘附；在LPS诱导的小鼠中，伊沙利丁E减轻主动脉和肺部炎症、改善血管通透性，并降低组织内TLR4和p-p65表达。
- 研究意义
- 研究提示伊沙利丁E可能作为治疗血管炎症性疾病的潜在治疗药物，尤其是在涉及内皮炎症或TLR4/NF-κB失调的疾病中。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单核细胞粘附实验
评估伊沙利丁E对LPS诱导的单核细胞-内皮细胞粘附的影响
HUVECs预处理伊沙利丁E 2小时，然后用LPS（1 μg/mL）刺激18小时，加入Calcein-AM标记的THP-1单核细胞共孵育1小时，洗去未粘附细胞，在荧光显微镜下计数粘附细胞数。
炎症因子和粘附分子表达检测
检测伊沙利丁E对LPS诱导的促炎因子和粘附分子表达的影响
用RT-qPCR检测TNF-α、ICAM-1、IL-1β、VCAM-1、IL-6和MCP-1的mRNA水平，并用Western blot验证TNF-α和ICAM-1的蛋白表达。
小鼠主动脉组织病理分析
评估伊沙利丁E对LPS诱导的小鼠主动脉炎症和组织损伤的影响
C57BL/6小鼠灌胃伊沙利丁E（25、50、100 mg/kg）或溶媒，连续3天，然后腹腔注射LPS（15 mg/kg）诱导炎症，12小时后处死小鼠，取主动脉，进行HE染色和免疫组化检测ICAM-1和TNF-α。
小鼠肺组织病理分析和血管通透性检测
评估伊沙利丁E对LPS诱导的肺组织炎症和血管通透性的影响
小鼠处死后取肺组织，进行HE染色和免疫组化检测ICAM-1和TNF-α；并用Evans Blue染料渗出实验评估肺血管通透性。
TLR4/NF-κB信号通路检测
探究伊沙利丁E抑制LPS诱导的内皮炎症的分子机制
通过Western blot检测HUVECs中TLR4、IκBα和p-p65的蛋白水平；通过免疫荧光检测p65的核转位。
体内TLR4/NF-κB通路验证
验证伊沙利丁E在体内对TLR4/NF-κB信号通路的抑制作用
对主动脉和肺组织进行免疫组化染色检测TLR4和磷酸化p65的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 伊沙利丁E | -- | -- | |
| 细胞培养 | 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸 | -- | -- | |
| M199培养基 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 肝素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| p-ECGF | -- | -- | |
| 流式分析 | 钙黄绿素-AM | Beyotime Biotechnology | -- |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript RT试剂盒（Perfect Real-Time） | Takara Bio Inc. | -- | |
| SYBR Green试剂 | Takara Bio Inc. | -- | |
| 引物 | Guangzhou Huiyuan Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Merck | -- |
| BCA试剂盒 | -- | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| TNF-α抗体 | Servicebio | -- | |
| ICAM-1抗体 | Servicebio | -- | |
| TLR4抗体 | Proteintech Group | -- | |
| IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| p-p65抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| β-actin抗体 | Proteintech Group | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Cell Signaling Technology | -- | |
| Pierce ECL Western blot底物 | Thermo Scientific | -- | |
| 动物实验 | 伊文思蓝 | -- | -- |
| 免疫组化 | ICAM-1抗体（免疫组化） | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| TNF-α抗体（免疫组化） | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| SABC过氧化物酶试剂盒 | Absin Bioscience | -- | |
| 免疫荧光 | NF-κB p65抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 化学结构 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 吐温80 | -- | -- | |
| 丙二醇 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HUVEC的分离和培养条件（培养基、血清浓度、细胞因子、传代次数等） 阅读提示：Methods 4.3 Cell Culture and Treatment |
| 单核细胞粘附实验 | THP-1细胞标记（Calcein-AM浓度和时间）、预处理时间、LPS浓度和处理时间、共孵育时间、计数方法 阅读提示：Methods 4.4 Monocyte Adhesion Assay |
| RT-qPCR | RNA提取试剂、反转录试剂盒、SYBR Green试剂、引物序列、定量方法（2ΔΔCt） 阅读提示：Methods 4.5 Quantitative Real-Time PCR |
| Western blot | 裂解缓冲液、蛋白酶抑制剂、抗体来源和稀释比例、内参（β-actin）、ECL底物 阅读提示：Methods 4.6 Western Blot |
| 动物实验 | 小鼠品系、性别、年龄、体重、饲养条件、分组、LPS剂量和注射途径、处理时间、灌胃剂量和体积 阅读提示：Methods 4.2 Animals |
| 组织病理和免疫组化 | 固定液、灌注液、切片厚度、抗原修复、抗体稀释、显色系统 阅读提示：Methods 4.8 Immunohistochemistry |
| 血管通透性检测 | Evans Blue浓度、注射体积、循环时间、取材和匀浆条件、检测波长 阅读提示：Methods 4.7 Evans Blue Staining of the Lungs |
| NF-κB核转位检测 | 固定、透化、封闭、一抗和二抗浓度、显微镜类型 阅读提示：Methods 4.9 Nuclear Translocation of NF-κB |