细胞毒性筛选
确定MPs和OA单独及联合暴露对Caco-2细胞活力的影响,选择后续实验浓度。
使用CCK-8法检测不同浓度MPs和OA处理24小时后的细胞活力,并计算OA的IC50。
Polystyrene Microplastics Can Aggravate the Damage of the Intestinal Microenvironment Caused by Okadaic Acid: A Prevalent Algal Toxin.
包含细胞活力、ROS、LDH、ABC转运体、基因表达及16S rRNA测序等多层次实验,但缺乏体内动物模型验证,实验完整度中等。
Caco-2细胞单层模型 体外粪便发酵体系(C57BL/6J小鼠粪便)
MPs浓度80 μg/mL,OA浓度20 ng/mL,处理24小时 ABC转运体活性检测使用Calcein-AM 16S rRNA测序分析体外发酵菌群 选用5 μm PS-MPs
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定MPs和OA单独及联合暴露对Caco-2细胞活力的影响,选择后续实验浓度。
使用CCK-8法检测不同浓度MPs和OA处理24小时后的细胞活力,并计算OA的IC50。
评估共暴露对细胞内ROS产生和炎症因子表达的影响。
使用DCFH-DA探针检测ROS水平,RT-qPCR检测IL-8和IL-18 mRNA表达。
检测共暴露对细胞内OA积累和ABC转运体功能的影响。
使用LC-MS/MS定量细胞内OA浓度,使用Calcein-AM评估ABC转运体活性。
评估共暴露对紧密连接和刷状缘相关基因表达的影响。
使用RT-qPCR检测紧密连接相关基因(Cldn2、Ocln、Zo-1)和刷状缘相关基因(Alpi、Si、Slc15a1)的表达。
探究共暴露对肠道菌群组成的影响。
使用小鼠粪便进行体外发酵,通过16S rRNA测序分析菌群多样性和组成。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Lonsera | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Biosharp | -- |
| ROS检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| DCFH-DA | -- | -- | |
| LDH检测 | 乳酸脱氢酶检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| ABC转运体活性检测 | 钙黄绿素-AM | Beyotime | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | -- | -- |
| 逆转录试剂盒 | Vazyme | R233-01 | |
| qPCR试剂盒 | Vazyme | -- | |
| 体外发酵 | GAM培养基 | Hopebiol | -- |
| 维生素K1 | -- | -- | |
| 氯化血红素 | -- | -- | |
| 16S rRNA测序 | Illumina Nova 6000测序平台 | Illumina | -- |
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| BioRad S1000 PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 仪器设备 | 多功能酶标仪 (CLARlOstar) | BMG LABTECH | -- |
| 酶标仪 (Cytation5) | BioTek Instruments | -- | |
| 细胞处理 | 聚苯乙烯微塑料 (5.0 μm) | Tianjin Base Line Chromatography Technology Development Center | -- |
| 冈田酸 | Algal Science Inc. | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞毒性实验 | MPs浓度80 μg/mL,OA浓度20 ng/mL,处理24小时 阅读提示:参见Materials and Methods 2.2节和图1 |
| ROS检测 | DCFH-DA浓度20 nM,孵育30分钟 阅读提示:参见Materials and Methods 4.5节 |
| ABC转运体活性检测 | Calcein-AM浓度0.25 mM,孵育30分钟 阅读提示:参见Materials and Methods 4.7节 |
| 体外发酵实验 | MPs浓度100 μg/mL和1 mg/mL,OA浓度80.5 ng/mL,厌氧培养24小时 阅读提示:参见Materials and Methods 4.9节 |
| 16S rRNA测序 | V3-V4区域,引物338F和806R 阅读提示:参见Materials and Methods 4.10节 |