构建可诱导活性的TRIAS并验证其抗原依赖性
验证TRIAS是否仅在抗原存在时激活，且在无抗原时保持低自激活。
将TRIAS和MAVS慢病毒转导MC38细胞，检测转导后不同时间点IFN-β释放；随后用抗原刺激，检测IFN-β释放。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一种靶向MAVS融合蛋白用于受控先天免疫激活和抗肿瘤治疗
A targeted MAVS fusion protein for controlled innate immune activation and antitumor therapy.
实验完整度
高包含体外细胞实验（IFN-β释放、免疫印迹、流式）、体内皮下肿瘤模型（CT26/MC38）及再挑战实验、RNA-seq等至少两个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
CT26结肠癌细胞系 MC38结肠癌细胞系 MC38结肠癌小鼠皮下移植瘤模型 表达TRIAS的MC38肿瘤疫苗
重点核对
TRIAS结构包含L19 scFv、CD8铰链、CD8跨膜结构域和截短MAVS胞内结构域 慢病毒载体：pTRPE骨架，EF1α启动子，P2A连接GFP 治疗剂量：静脉注射1×10^7 TU；瘤内注射1×10^6 TU，每3天一次，共3次 抗原刺激：EDB-his蛋白2 μg/mL 动物模型：BALB/c小鼠CT26模型，C57BL/6小鼠MC38模型
摘要
摘要：利用先天免疫系统的靶向治疗正在成为有前景的癌症治疗方法。线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）在启动先天免疫反应中起着关键作用，但其临床应用受到不受控制的激活和全身毒性风险的限制。为了解决这个问题，我们开发了一种新型治疗剂，即截短型干扰素激活开关（TRIAS），将MAVS截短体与肿瘤抗原靶向单链可变片段（scFv）相结合。这种设计确保了抗原依赖性、受控的激活。慢病毒递送TRIAS诱导了显著的抗肿瘤反应，包括在某些情况下完全肿瘤消退。流式细胞术（FCM）分析进一步证实，肿瘤细胞是表达转基因的主要群体。表达TRIAS的肿瘤细胞表现出增强的抗肿瘤活性，这可能是由于细胞因子释放增加和主要组织相容性复合体（MHC）表达上调，使肿瘤细胞能够作为抗原呈递细胞发挥作用。这激活了其他免疫细胞，驱动适应性免疫反应。此外，TRIAS促进了肿瘤微环境（TME）向促炎性转变。总之，TRIAS被验证为一种创新的免疫治疗剂，具有MAVS样免疫激活特性和严格控制的机制，为临床癌症免疫治疗提供了一种更安全、更有效的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否设计一种受控的MAVS激活策略，在避免全身毒性的同时实现有效的抗肿瘤免疫？
- 核心机制
- TRIAS通过抗原依赖性激活，促进IRF-3和NF-κB磷酸化，诱导IFN-β等促炎细胞因子释放，上调MHC I/II分子表达，增强肿瘤细胞抗原呈递，激活适应性免疫，并重塑肿瘤微环境至促炎状态。
- 主要证据
- 体外实验显示TRIAS在抗原刺激下诱导IFN-β释放和IRF-3/NF-κB磷酸化，上调MHC分子表达；体内模型中，TRIAS慢病毒瘤内注射导致MC38肿瘤完全消退，并产生免疫记忆；RNA-seq显示TRIAS处理组富集I型干扰素和炎症通路。
- 研究意义
- TRIAS作为一种具有MAVS样免疫激活特性和抗原依赖性可控机制的靶向免疫治疗剂，为临床癌症免疫治疗提供了更安全、更有效的方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估TRIAS体内抗肿瘤效果和安全性
比较静脉注射和瘤内注射慢病毒TRIAS的抗肿瘤疗效和毒性。
在CT26和MC38皮下肿瘤模型中，分别通过静脉或瘤内注射慢病毒，测量肿瘤体积和体重。
验证TRIAS肿瘤细胞的体外免疫刺激效应
确认TRIAS表达在肿瘤细胞上是否通过抗原刺激激活下游信号并增强免疫原性。
构建TRIAS MC38细胞，用抗原刺激后检测IRF-3/NF-κB磷酸化、MHC I/II表达和细胞活力。
评估TRIAS肿瘤细胞疫苗的体内抗肿瘤作用
测试静脉注射TRIAS MC38细胞作为治疗性疫苗的疗效。
在MC38皮下肿瘤模型中，尾静脉注射TRIAS MC38细胞，监测肿瘤生长和体重。
分析TRIAS肿瘤细胞治疗后的肿瘤微环境变化
揭示TRIAS治疗对肿瘤内细胞因子、免疫浸润和转录组的影响。
治疗后48小时检测肿瘤内IFN-β水平，一周后通过流式分析免疫细胞浸润，并进行RNA-seq比较基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 非必需氨基酸 | -- | -- | |
| 慢病毒包装 | 293 ExpiFectamine转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | A14525 |
| Lenti-X浓缩器 | Takara | 631232 | |
| 体外实验 | D-荧光素 | Yeasen | 40902ES03 |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Yeasen | 20101ES60 |
| 蛋白酶抑制剂 | Yeasen | 20124ES03 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Yeasen | 20109ES05 | |
| NF-κB p65/RelA兔单克隆抗体 | ABclonal | A19653 | |
| 磷酸化NF-κB p65 (C22B4)兔单克隆抗体 | CST | 3033S | |
| IRF-3兔单克隆抗体 | ABclonal | A19717 | |
| 磷酸化IRF-3 (Ser396) (4D4G)兔单克隆抗体 | CST | 4947S | |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | WBKLS0500 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8溶液 | Yeasen | 40203ES76 |
| 流式分析 | APC偶联抗小鼠H-2Kb抗体 | Biolegend | 116517 |
| PerCP偶联抗小鼠MHC II (I-A/I-E)抗体 | Elabscience | E-AB-F0990F | |
| 胶原酶I | -- | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| ACK裂解缓冲液 | Yuanye | R20172 | |
| 纯化的大鼠抗小鼠CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD | 553141 | |
| 可固定活力染料780 | BD | 565388 | |
| Alexa Fluor 700大鼠抗小鼠CD45 (30-F11) | BD | 560510 | |
| LSR流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞因子检测 | IFN-β ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00420 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0011 |
| 体内成像 | IVIS Spectrum小动物活体成像系统 | Perkin Elmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 慢病毒构建与包装 | 慢病毒载体骨架为pTRPE，启动子EF1α；包装细胞HEK293T，共转染pLP1、pLP2、pVSV-G；浓缩方法Lenti-X Concentrator 阅读提示：详见Materials and methods: Construction of lentiviral plasmid |
| 体外抗原刺激实验 | EDB-his蛋白浓度为2 μg/mL，刺激时间48小时；检测IFN-β释放、MHC表达、磷酸化 阅读提示：详见Materials and methods: Detection of IFN-β release, Immunoblotting, Detection of MHC molecules |
| 体内治疗实验 | 肿瘤细胞接种数量：CT26 5×10^5，MC38 1×10^6；治疗方式：静脉注射或瘤内注射；剂量：静脉1×10^7 TU单次，瘤内1×10^6 TU三次；动物品系：BALB/c (CT26), C57BL/6 (MC38) 阅读提示：详见Materials and methods: Mouse models, 图2图例 |
| 肿瘤细胞疫苗实验 | TRIAS MC38细胞制备：慢病毒转导后FACS分选；体内模型：MC38皮下瘤，尾静脉注射1×10^6细胞 阅读提示：详见Materials and methods: Manufacture of TRIAS MC38 cells, Mouse models |
| 转录组分析 | 肿瘤组织提取RNA，文库制备和测序由GENEWIZ完成；差异表达分析使用edgeR，Padj<0.05；GSEA分析使用DESeq2归一化计数 阅读提示：详见Materials and methods: Bulk RNA sequencing |