Ube3d敲除小鼠模型构建
研究UBE3D在胚胎发育中的功能。
利用CRISPR/Cas9技术敲除Ube3d基因exon2，通过杂交获得纯合胚胎，并通过基因分型和蛋白质印迹确认敲除效率。
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小鼠体内UBE3D的缺乏导致严重的胚胎异常，并通过CPSF3破坏同源盒基因的mRNA
Deficiency of UBE3D in mice leads to severe embryonic abnormalities and disrupts the mRNA of Homeobox genes via CPSF3.
实验完整度
高包括基因敲除小鼠表型分析、原位杂交和免疫荧光、RNA-seq转录组分析、qRT-PCR验证、蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀和泛素化分析等多个独立证据层级，并进行功能验证和机制探究。
主要模型
Ube3d敲除小鼠胚胎（E8.5–E11.5） HEK 293T细胞
重点核对
Ube3d基因敲除小鼠模型（C57BL/6背景） 基因型鉴定：WT、HET、HOMO胚胎的比例 E10.5胚胎RNA-seq和qRT-PCR分析 HEK 293T细胞中siRNA敲低UBE3D CPSF3显性负性突变体过表达实验
摘要
神经管形成是脊椎动物早期胚胎发生过程中的关键事件，该过程的异常可导致胚胎致死或先天性障碍，如神经管缺陷。通过我们先前在小鼠中进行的表型驱动筛选，我们已确定UBE3D是神经管形成过程的关键因子。通过使用CRISPR/Cas9技术生成Ube3d敲除小鼠，我们观察到纯合小鼠表现出严重的生长迟缓和畸形，最终在E10.5至E11.5之间死亡。与其野生型和杂合子同窝小鼠相比，纯合胚胎在E9.5时表现出小头和未翻转的尾部神经管。我们的原位杂交和免疫荧光实验显示，UBE3D在E9.5–10.5的前脑、神经管和心脏中高表达。此外，对E10.5胚胎的RNA-seq分析表明，UBE3D的缺乏导致多个同源盒基因的下调，包括那些在前脑和腰骶区域特异性表达的基因。我们还发现UBE3D与CPSF3相互作用，CPSF3是前体mRNA 3'端加工所必需的内切核酸酶。UBE3D可以去泛素化CPSF3，而UBE3D的缺乏导致小鼠和人类细胞中CPSF3水平降低。过表达CPSF3的显性负性突变体被发现能部分降低几个同源盒基因的mRNA水平。总之，我们的发现强调UBE3D对小鼠早期胚胎发育至关重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- UBE3D在小鼠早期胚胎发育（特别是神经管形成）中的作用及其分子机制。
- 核心机制
- UBE3D与CPSF3相互作用，并通过去泛素化稳定CPSF3蛋白；UBE3D缺乏导致CPSF3蛋白水平降低，进而导致多个同源盒基因mRNA下调。
- 主要证据
- Ube3d敲除小鼠胚胎表现出生长迟缓和形态异常，RNA-seq和qRT-PCR显示多个同源盒基因下调；免疫共沉淀和泛素化实验证明UBE3D与CPSF3相互作用并去泛素化CPSF3；过表达CPSF3显性负性突变体部分降低同源盒基因mRNA水平。
- 研究意义
- 揭示UBE3D在早期胚胎发育中的关键作用，通过调控CPSF3和同源盒基因影响神经管形成和器官发生，为理解神经管缺陷等先天性疾病提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
胚胎表型分析
观察UBE3D缺陷对胚胎形态和发育的影响。
在不同发育阶段收集胚胎，测量大小，观察神经管、心脏、脑和肢体等形态异常，并统计基因型比例。
UBE3D表达模式分析
确定UBE3D在胚胎发育阶段的表达部位。
使用地高辛标记的RNA探针进行整体原位杂交，并使用免疫荧光染色检测UBE3D蛋白在E9.5–11.5胚胎切片中的表达。
转录组分析
鉴定UBE3D缺失导致的基因表达变化。
提取E10.5胚胎总RNA进行RNA-seq，筛选差异表达基因，进行GO富集分析，并重点分析同源盒基因的表达变化。
UBE3D对CPSF3的调控机制研究
探究UBE3D是否通过调控CPSF3影响同源盒基因表达。
通过免疫共沉淀验证UBE3D与CPSF3相互作用，泛素化实验检测UBE3D对CPSF3多泛素化水平的影响，并检测UBE3D敲低或敲除后CPSF3蛋白水平。
CPSF3突变体对同源盒基因表达的影响
验证CPSF3功能缺失是否导致同源盒基因下调。
构建CPSF3显性负性突变体（SM: H73A；DM: D75K/H76A），在HEK 293T细胞中过表达，通过qRT-PCR检测11个下调同源盒基因及Nkx2-5的表达水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因敲除小鼠构建 | CRISPR/Cas9 | -- | -- |
| 蛋白提取和免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白分离 | SDS-PAGE上样缓冲液 | Beyotime | P0015L |
| 蛋白转移 | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| 蛋白检测 | Tanon™5200CE化学发光成像系统 | Tanon | -- |
| 免疫荧光染色 | OCT包埋剂 | Sakura | 4583 |
| 免疫荧光切片 | 冰冻切片机 | Leica | CM190 |
| 免疫荧光染色 | DAPI | -- | -- |
| 免疫荧光成像 | 蔡司LSM 700共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 原位杂交 | MEGAshortscript™试剂盒 | Invitrogen | AM1354 |
| 原位杂交显色 | BM Purple AP底物 | Roche | 11442074001 |
| RNA测序 | Illumina NovaSeq6000 | Illumina | -- |
| Western blot | 抗UBE3D抗体 | Abcam | ab121927 |
| 抗CPSF73抗体 | Abcam | ab72295 | |
| 抗Flag抗体 | Engibody | AT0022 | |
| 抗Myc抗体 | Origene | TA1501215 | |
| 抗VINCULIN抗体 | Abcam | ab129002 | |
| 抗UAP56抗体 | ABclonal | A9749 | |
| 抗HA抗体 | Beyotime | AF2858 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(H+L) | Beyotime | A0208 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(H+L) | Beyotime | A0216 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor® 488标记的山羊抗兔 | Abcam | ab150077 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 细胞转染 | Lipo3000转染试剂 | Glpbio | GK20006 |
| siRNA转染 | X-tremeGENE™ siRNA转染试剂 | Roche | 04476093001 |
| 细胞处理 | MG132 | MCE | HY-13259 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026CN |
| 反转录 | Vazyme反转录试剂盒 | Vazyme | -- |
| qRT-PCR | ChamQ Universal SYBR qPCR预混液试剂盒 | Vazyme | Q71102 |
| LightCycler® 480 II实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 免疫共沉淀 | Protein A+G琼脂糖珠 | Beyotime | P2055 |
| 泛素化实验 | 蛋白酶抑制剂 | Glpbio | GK10017 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因敲除小鼠模型 | Ube3d基因敲除小鼠的构建方法（CRISPR/Cas9）、sgRNA序列、基因型鉴定引物、胚胎收集时间点 阅读提示：见Materials and methods: Mouse maintenance and embryo dissection |
| 胚胎表型分析 | 胚胎发育阶段（E8.5-11.5）、测量参数、观察的形态异常 阅读提示：见Results: Ube3d−/− mice exhibited significant developmental delays... 及Figure 1 |
| RNA-seq分析 | RNA提取方法、测序平台、差异表达基因筛选标准（fold change、q值）、样本量 阅读提示：见Materials and methods: RNA sequencing 及 Results: Multiple Homeobox genes were downregulated... |
| UBE3D与CPSF3相互作用和去泛素化 | 质粒构建（UBE3D-Flag、CPSF3-Myc等）、转染条件、MG132浓度和处理时间、免疫共沉淀和泛素化实验步骤 阅读提示：见Materials and methods: Co-immunoprecipitation (co-IP) 和 Ubiquitination assays |
| 细胞培养和siRNA敲低 | HEK 293T细胞来源、培养条件、siRNA序列、转染试剂和浓度、检测时间点 阅读提示：见Materials and methods: Cell culture and transfection 和 Results: Deficiency of UBE3D impairs CPSF3... |