筛选并验证高脂饮食下差异表达的 lncRNA
鉴定与肝脏脂质代谢相关的候选 lncRNA。
对正常饮食和高脂饮食小鼠肝脏进行 lncRNA 测序，结合 KEGG 富集分析筛选与脂肪酸降解相关的差异表达 lncRNA，并通过 qRT-PCR 验证。
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LncRNA Gm35585 转录激活过氧化物酶 EHHADH 对抗饮食诱导的脂肪肝
LncRNA Gm35585 transcriptionally activates the peroxidase EHHADH against diet-induced fatty liver.
实验完整度
高包含体内小鼠模型、体外细胞模型及 RNA-seq、qPCR、Western blot、RNA pulldown、ChIP、Co-IP 等多层级功能与机制验证。
主要模型
高脂饮食诱导的 DIO 小鼠模型 AML-12 小鼠肝细胞 HepG2 人肝癌细胞
重点核对
Gm35585 过表达载体（AAV-Gm35585，4.37×10^12 vg/ml）与阴性对照 AAV-NC（1.8×10^11 vg/ml） EHHADH 过表达载体（TBG-EHHADH，1.02×10^12 vg/ml）与对照 TBG-NC（5.78×10^13 vg/ml） 高脂饮食（60% 脂肪）喂养时长（DIO 小鼠 10 周，EHHADH 实验小鼠 4 周） 体外高脂模型：0.2 mM 棕榈酸（PA）处理 24 小时 PPARα 激动剂 GW7647（5 μM）和抑制剂 GW6471（1 μM）处理
摘要
代谢功能障碍相关脂肪性肝病是全球最常见的慢性肝病之一，目前尚无获批的治疗方法。本文报道，肝脏过表达 Gm35585（一种在高脂饮食小鼠肝脏中下调的新型 lncRNA）在缓解肝脏脂质积累病理方面具有重要功能。Gm35585 激活过氧化物酶体增殖物激活受体 α（PPARα）信号通路，并促进 PPARα 下游靶基因烯酰辅酶 A 水合酶和 3-羟酰辅酶 A 脱氢酶（EHHADH）的表达，EHHADH 是过氧化物酶体 β-氧化途径的四种酶之一。EHHADH 的激活促进长链脂肪酸（LCFAs）的氧化，而肝脏 LCFAs 水平的升高有助于代谢功能障碍相关脂肪性肝病。机制上，Gm35585 与维甲酸 X 受体 α（RXRα）结合，然后与 PPARα 形成 PPARα/RXRα 异二聚体，并引导该异二聚体识别 EHHADH 的启动子（称为过氧化物酶体增殖物激活受体反应元件），导致 EHHADH 的转录激活。总之，Gm35585 是一种肝脏脂质代谢调节因子，通过激活 EHHADH 转录，促进 LCFAs 的过氧化物酶体 β-氧化，最终改善饮食诱导的脂肪肝。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 新型 lncRNA Gm35585 是否以及如何在高脂饮食诱导的脂肪肝中调节肝脏脂质代谢？
- 核心机制
- Gm35585 与 RXRα 结合，促进 PPARα/RXRα 异二聚体形成，该异二聚体结合 EHHADH 启动子区域（PPRE），转录激活 EHHADH，增强过氧化物酶体 β-氧化，促进长链脂肪酸分解。
- 主要证据
- 小鼠体内过表达 Gm35585 或 EHHADH 减轻肝脏脂质积累；体外 AML-12 和 HepG2 细胞实验证实 Gm35585 通过 EHHADH 降低脂质含量；RNA pulldown 显示 Gm35585 直接结合 RXRα；Co-IP 和 ChIP 验证 RXRα-PPARα 相互作用及 RXRα 结合 EHHADH 启动子。
- 研究意义
- 揭示 Gm35585 作为肝脏脂质代谢调节因子的新机制，为 MASLD 治疗提供潜在的新靶点和治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证 Gm35585 对肝细胞脂质积累的影响
验证 Gm35585 过表达是否能缓解棕榈酸诱导的肝细胞脂质积累。
在 AML-12 和 HepG2 细胞中转染 pEX-3-Gm35585 质粒，建立 PA 诱导的高脂模型，通过 TG 检测和 Nile Red 染色评估脂质含量。
体内验证 Gm35585 过表达对高脂饮食小鼠脂肪肝的影响
验证 Gm35585 过表达是否改善高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂质积累。
通过尾静脉注射 AAV-Gm35585 或 AAV-NC 至 HFD 小鼠，检测体重、肝脏 TG/TC 水平、血清生化指标和 Oil Red O 染色。
验证 Gm35585 通过 EHHADH 促进长链脂肪酸氧化
验证 Gm35585 是否通过上调 EHHADH 增强过氧化物酶体 β-氧化，降低肝脏 LCFA 含量。
通过 qPCR、Western blot、免疫荧光、过氧化物酶活性测定和 LC-MS/MS 检测肝脏脂肪酸谱。
验证 PPARα 信号通路介导 Gm35585 对 EHHADH 的激活
验证 Gm35585 是否通过 PPARα 信号通路调节 EHHADH 表达。
使用 PPARα 激动剂 GW7647 和抑制剂 GW6471 处理 AML-12 细胞，结合 siRNA 敲低，检测 EHHADH 表达和脂质含量。
验证 Gm35585 与 RXRα 结合并促进 PPARα/RXRα 异二聚体形成
探索 Gm35585 激活 EHHADH 转录的分子机制。
通过 RNA pulldown、银染、质谱鉴定 Gm35585 结合蛋白，并通过 Co-IP 验证 PPARα-RXRα 相互作用，ChIP 验证 RXRα 结合 EHHADH 启动子。
验证 siRXRα 逆转 Gm35585 的降脂效应
验证 RXRα 在 Gm35585 调节 EHHADH 和脂质代谢中的必要性。
在 AML-12 细胞中沉默 RXRα，检测 EHHADH 表达、TG 水平和脂质含量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验（病毒载体） | AAV-Gm35585 腺相关病毒 | GenePharma | 4.37×10^12 vg/ml |
| AAV-NC 阴性对照腺相关病毒 | GenePharma | 1.8×10^11 vg/ml | |
| TBG-EHHADH 腺相关病毒 | GenePharma | 1.02×10^12 vg/ml | |
| TBG-NC 阴性对照腺相关病毒 | GenePharma | 5.78×10^13 vg/ml | |
| 细胞培养 | AML-12 细胞 | Procell | -- |
| AML-12 完全培养基 | Procell | -- | |
| DMEM 培养基 | Gibco | -- | |
| 细胞处理（高脂模型） | 棕榈酸 | Sangon Biotech | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000 转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 药物处理 | GW7647 | MedChemExpress | -- |
| GW6471 | MedChemExpress | -- | |
| RNA 提取 | TRIzol 试剂 | Vazyme Biotech | -- |
| 生化指标测定 | 谷丙转氨酶检测试剂盒 | Whitman | -- |
| 谷草转氨酶检测试剂盒 | Whitman | -- | |
| 游离脂肪酸检测试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Jiancheng | -- | |
| 总胆固醇检测试剂盒 | Jiancheng | -- | |
| 高密度脂蛋白检测试剂盒 | Jiancheng | -- | |
| 低密度脂蛋白检测试剂盒 | Jiancheng | -- | |
| 染色 | 油红 O | Servicebio | -- |
| 显微观察 | BX-53 显微镜 | Olympus | -- |
| 脂肪酸含量测定 | QTrap 5500 质谱仪 | AB Sciex | -- |
| Agilent Poroshell 120 C18 色谱柱 | Agilent | -- | |
| Analyst 工作站软件 | AB Sciex | -- | |
| 过氧化物酶活性测定 | 过氧化物酶活性检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| RT-qPCR | HiScript Q RT SuperMix 逆转录试剂 | Vazyme Biotech | -- |
| AceQ qPCR SYBR Green 预混液 | Vazyme Biotech | -- | |
| StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 仪 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | PVDF 膜 | Millipore | -- |
| Tanon-5200 Multi 化学发光成像系统 | Tanon | -- | |
| 免疫荧光 | FV3000 激光共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| RNA pulldown | 磁珠法 RNA-蛋白质下拉试剂盒 | BersinBio | -- |
| 银染 | 快速银染试剂盒 | Beyotime | -- |
| ChIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Beyotime | -- |
| Co-IP | 通用免疫沉淀试剂盒 | Abbkine | -- |
| 抗体 | β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig |
| CD36 抗体 | Abclonal | A1470 | |
| CPT1α 抗体 | Proteintech | 15184-1-AP | |
| EHHADH 抗体 | Proteintech | 26570-1-AP | |
| GAPDH 抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| Lamin B1 抗体 | Affinity | AF5161 | |
| PPARα 抗体 | Affinity | AF5301 | |
| RXRα 抗体（WB） | Proteintech | 60198-1-Ig | |
| RXRα 抗体（Co-IP, ChIP） | Abcam | ab125001 | |
| RXRβ 抗体 | Proteintech | 14684-1-AP | |
| HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 二抗 | Thermo | 31430 | |
| HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗 | Thermo | 31460 | |
| Alexa Fluor 647 山羊抗兔 IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-605-144 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | DIO 小鼠（5 周龄 C57BL/6J）高脂饲料（60% 脂肪）喂养 10 周；EHHADH 实验小鼠高脂喂养 4 周 阅读提示：Materials and methods: Animal treatment |
| 病毒注射 | AAV-Gm35585 或 AAV-NC 通过尾静脉注射（100 μl/只，滴度信息见文中），注射后 10 天检测；TBG-EHHADH 或 TBG-NC 注射后 1 个月检测 阅读提示：Materials and methods: Animal treatment; Results: Gm35585 overexpression ameliorates...; Results: Gm35585 overexpression enhances... |
| 体外高脂模型 | AML-12 或 HepG2 细胞，0.2 mM 棕榈酸处理 24 小时 阅读提示：Materials and methods: Cell treatment |
| 质粒转染 | pEX-3-Gm35585 质粒（0.4 μg/5000 细胞）转染 24 小时 阅读提示：Materials and methods: Cell treatment |
| siRNA 转染 | siRNA（0.8 μM/2×10^4 细胞）转染 24 小时 阅读提示：Materials and methods: Cell treatment; Table 1 |
| PPARα 激动剂/抑制剂处理 | GW7647（5 μM）或 GW6471（1 μM）处理 24 小时 阅读提示：Materials and methods: Cell treatment |
| 脂肪酸含量检测 | LC-MS/MS 方法：QTrap 5500 质谱仪，Agilent Poroshell 120 C18 柱，流动相 0.5% 甲酸-乙腈，流速 500 μl/min，柱温 40°C，进样量 2.0 μl 阅读提示：Materials and methods: FA content assay |
| ChIP 实验 | RXRα 抗体 ChIP，EHHADH 启动子引物序列（F: 5′-TGACCGAGTCCTACAGATGG-3′, R: 5′-GTTGCCAAAGTCCACCAAGT-3′） 阅读提示：Materials and methods: ChIP assay; Results: Activation of the Gm35585–PPARα/RXRα–EHHADH axis... |