HOXA5 Derives the Malignant Progression and Cisplatin Resistance of Esophageal Squamous Cell Carcinoma by Regulating USP18-Mediated IFI27 Deubiquitination.
研究包含细胞系模型、临床样本分析、功能实验及机制验证，但缺乏动物体内实验，证据层级不够完整。
DDP耐药ESCC细胞系TE1/DDP和KYSE450/DDP 亲本ESCC细胞系TE1和KYSE450 人正常食管上皮细胞系HEEC ESCC临床组织样本（66例，含37例DDP耐药和29例DDP敏感）
TE1/DDP和KYSE450/DDP细胞由亲本细胞经递增浓度顺铂反复脉冲处理建立，培养基中含10 μM DDP维持耐药表型 细胞转染使用Lipofectamine 3000试剂，转染后孵育48小时 DDP耐药性通过IC50值评估，MTT法检测，细胞以5×10^3/孔接种，处理不同浓度DDP 48小时 蛋白稳定性实验使用50 μg/mL环己酰亚胺处理0、5、10、20、25小时 ChIP实验使用SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP Kit，细胞数1×10^6，预测结合位点#1和#2
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测IFI27在DDP耐药ESCC组织和细胞中的表达水平，以评估其与DDP耐药的相关性。
利用GEO数据集GSE160299分析IFI27在KYSE450/DDP和KYSE450细胞中的表达；利用TCGA和ENCORI数据库分析ESCA样本中IFI27的表达；RT-qPCR和western blot检测临床样本和细胞系中IFI27表达；MTT法检测TE1/DDP和KYSE450/DDP细胞及其亲本细胞对DDP的IC50值。
评估IFI27敲低对DDP耐药、细胞活力、增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。
在TE1/DDP和KYSE450/DDP细胞中转染si-IFI27或si-NC，通过western blot验证敲低效率，MTT检测IC50和细胞活力，EdU检测增殖，流式细胞术检测凋亡，Transwell检测侵袭，伤口愈合检测迁移，western blot检测MRP1表达。
验证USP18是否通过去泛素化调控IFI27蛋白稳定性。
利用STRING预测USP18与IFI27相互作用；在TE1/DDP和KYSE450/DDP细胞中敲低或过表达USP18，检测IFI27蛋白表达；使用MG132处理验证蛋白酶体依赖降解；CHX实验检测蛋白半衰期；CoIP验证内源性结合；泛素化实验检测IFI27泛素化水平。
验证IFI27过表达是否能逆转USP18敲低对细胞恶性行为和DDP敏感性的影响。
在TE1/DDP和KYSE450/DDP细胞中共转染si-USP18和OE-IFI27或对照，检测IC50、MRP1表达、细胞活力、增殖、凋亡、侵袭和迁移。
鉴定USP18的上游转录因子，并验证其结合和调控作用。
使用Genecards、JASPAR和PROMO预测USP18启动子潜在转录因子；敲低HOXA5和POU2F1后检测USP18表达；JASPAR预测HOXA5结合位点；双荧光素酶报告实验验证HOXA5对USP18启动子活性的影响；ChIP验证结合；western blot检测HOXA5敲低对USP18蛋白水平的影响。
验证HOXA5通过USP18调控IFI27表达，完成调节轴的功能验证。
在TE1/DDP和KYSE450/DDP细胞中转染si-HOXA5或si-HOXA5+OE-USP18，检测IFI27蛋白水平。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Invitrogen | -- |
| 顺铂 | -- | 15663-27-1 | |
| RNA提取 | RNAsimple总RNA提取试剂盒 | Tiangen | DP419 |
| RT-qPCR | LunaScript反转录预混试剂盒 | NEB | E3010 |
| Power SYBR Green预混液 | Invitrogen | 4367659 | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Keygen | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| ECL化学发光试剂 | Millipore | -- | |
| IFI27抗体 | Abcam | ab171919 | |
| MRP1抗体 | CST | 72202 | |
| USP18抗体 | CST | 4813 | |
| HOXA5抗体 | Abcam | ab140636 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| MTT实验 | MTT溶液 | Sigma-Aldrich | -- |
| EdU实验 | EdU溶液 | RiboBio | -- |
| DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC | Invitrogen | -- |
| 碘化丙啶 | Invitrogen | -- | |
| 侵袭实验 | 基质胶 | Solarbio | -- |
| 结晶紫 | Beyotime | -- | |
| CoIP | 免疫沉淀裂解液 | Invitrogen | -- |
| 蛋白A/G磁珠 | Millipore | -- | |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | CST | -- |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本处理 | 样本获取和分组：66例ESCC患者，按DDP化疗响应分为耐药组（37例）和敏感组（29例），具体定义需核对 阅读提示：Materials and Methods 2.1 |
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件：HEEC（BNCC359279）、TE-1（CL-0231）、KYSE450（STM-CL-5553）在RPMI-1640培养基中培养；DDP耐药细胞建立方法（重复脉冲处理）和维持浓度（10 μM DDP）需核对 阅读提示：Materials and Methods 2.1 |
| RT-qPCR | 引物序列（Table 1）：IFI27、USP18、GAPDH的引物序列；内参基因GAPDH；计算方法2-ΔΔCt 阅读提示：Materials and Methods 2.2, Table 1 |
| 细胞转染 | siRNA序列和过表达质粒构建：si-IFI27、si-USP18、si-HOXA5、si-POU2F1、si-NC（GenePharma合成）；OE-USP18（NM_017414.4）、OE-IFI27（NM_001130080.3）克隆至pcDNA载体；转染试剂Lipofectamine 3000，孵育48小时 阅读提示：Materials and Methods 2.4 |
| 蛋白质印迹 | 抗体信息：IFI27 (ab171919, 1:1000)、MRP1 (#72202, 1:1000)、USP18 (#4813, 1:1000)、HOXA5 (ab140636, 1:1000)、GAPDH (ab9485, 1:2500)；二抗孵育时间2小时；蛋白上样量等未明确 阅读提示：Materials and Methods 2.3 |
| MTT实验 | 细胞密度5×10^3/孔，DDP浓度梯度处理48小时，MTT浓度5 mg/mL，孵育4小时，DMSO溶解，490 nm测吸光度；IC50计算需核对 阅读提示：Materials and Methods 2.5 |
| EdU实验 | 细胞密度4×10^4/孔于24孔板，EdU浓度20 μM，孵育2小时；4%甲醛固定，Apollo反应30分钟，DAPI染色 阅读提示：Materials and Methods 2.6 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC 5 μL和PI 10 μL，避光孵育15分钟，1小时内流式检测 阅读提示：Materials and Methods 2.7 |
| 侵袭实验 | Matrigel浓度50 μL包被，细胞数1×10^5，孵育24小时，0.1%结晶紫染色，计数5个视野 阅读提示：Materials and Methods 2.8 |
| 迁移实验 | 细胞80%融合时划痕，无血清培养24小时，0和24小时拍照 阅读提示：Materials and Methods 2.9 |
| CoIP | IP裂解液裂解15分钟，抗体孵育16小时，蛋白A/G磁珠；需要核对抗体是否为IP级 阅读提示：Materials and Methods 2.10 |
| 泛素化实验 | si-USP18处理细胞，抗IFI27免疫沉淀，抗Ub检测；具体步骤未详述 阅读提示：Materials and Methods 2.11 |
| ChIP | 细胞数1×10^6，1%甲醛交联30分钟，甘氨酸终止；HOXA5抗体孵育过夜；结合位点#1和#2预测 阅读提示：Materials and Methods 2.12 |
| 双荧光素酶报告实验 | USP18启动子WT和MUT序列（含位点1）克隆至pmirGLO质粒，共转染si-NC或si-HOXA5，48小时后检测荧光素酶活性 阅读提示：Materials and Methods 2.13 |
