miR-372-3p 通过 RhoC/ROCK 通路抑制肝星状细胞活化

miR-372-3p represses hepatic stellate cell activation via the RhoC/ROCK pathway.

作者信息Shiyu Ou, Xiaoling Tang, Zhongzhuan Li, Rong Ouyang, Yuan Lei, Gang Chen, Ling Du

PMID39959789

期刊Cytotechnology

发布时间2025-04

DOI10.1007/s10616-025-00715-9

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实验完整度

中

该研究包含体外细胞模型（LX-2细胞）下的功能验证（增殖、凋亡）和机制验证（双荧光素酶报告基因、Western blot检测通路蛋白），但缺乏体内动物模型验证。

主要模型

人肝星状细胞系 LX-2 293T 细胞

重点核对

TGF-β1 诱导 LX-2 细胞活化（5 ng/ml，48 h） miR-372-3p mimic 或 oe-RhoC 转染浓度（50 nM 或 2 μg）双荧光素酶报告基因实验验证 miR-372-3p 与 RhoC 靶向关系 CCK-8 检测细胞增殖（5×10^3 细胞/孔） Annexin V-FITC/PI 双染检测细胞凋亡

摘要

本研究旨在确定 miR-372-3p 激活肝星状细胞（HSC）的机制。用转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导 LX-2 细胞，并转染 miR-372-3p 模拟物和/或 RhoC 过表达载体（oe-RhoC），随后检测 miR-372-3p 和 RhoC 的表达，并评估转染细胞的生物学功能。使用双荧光素酶实验验证了在线预测的 miR-372-3p 与 RhoC 的关系。使用蛋白质印迹检测 I 型胶原蛋白（COL I）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）以及 RhoC/ROCK 通路关键蛋白的蛋白水平。活化的 LX-2 细胞中 miR-372-3p 表达降低，RhoC 表达升高。miR-372-3p 过表达导致 LX-2 细胞增殖受抑、凋亡加速、COL I 和 α-SMA 蛋白水平降低，而这种表达模式可被 RhoC 过表达部分逆转。miR-372-3p 可以结合并靶向 RhoC 表达。miR-372-3p 抑制 RhoC 表达以阻断 Rho/ROCK 通路的激活，从而介导 LX-2 细胞的增殖和凋亡。miR-372-3p 介导 RhoC/ROCK 通路抑制 HSC 活化。

细胞培养与活化诱导

建立肝星状细胞活化模型，并验证 TGF-β1 诱导后细胞活化表型及 miR-372-3p 表达变化。

人 HSC 系 LX-2 细胞用含 5 ng/mL TGF-β1 的培养基培养 48 小时诱导活化，对照组加入 PBS；通过倒置显微镜观察形态变化，RT-qPCR 检测 miR-372-3p 表达。

细胞转染与分组处理

过表达 miR-372-3p 和 RhoC，以观察其对 LX-2 细胞活化的影响。

使用 Lipofectamine 2000 将 miR-372-3p mimic、oe-RhoC 载体及相应阴性对照转染至 LX-2 细胞，设置空白组、TGF-β1 组、TGF-β1+miR-NC 组、TGF-β1+miR 组、TGF-β1+miR+oe-NC 组、TGF-β1+miR+oe-RhoC 组。

细胞功能检测

检测 miR-372-3p 过表达对 LX-2 细胞增殖、凋亡及活化标志物表达的影响。

采用 CCK-8 法检测细胞增殖，Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测凋亡，Western blot 检测 COL I 和 α-SMA 蛋白表达。

靶向验证

验证 miR-372-3p 与 RhoC 的靶向结合关系。

通过生物信息学预测结合位点，构建 RhoC-WT 和 RhoC-MUT 荧光素酶报告载体，共转染至 293T 细胞，48 小时后检测荧光素酶活性。

机制验证

检测 miR-372-3p 对 RhoC/ROCK 通路关键蛋白的影响，以阐明其抑制 HSC 活化的分子机制。

通过 Western blot 检测 RhoC、ROCK2、MLC2 和 p-MLC2 的蛋白水平。

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养	DMEM 培养基	Gibco	--
胎牛血清	--	--
青霉素/链霉素	Gibco	--
胰蛋白酶	Gibco	--
细胞培养诱导	转化生长因子-β1	Sigma-Aldrich	H8541
细胞转染	Lipofectamine 2000 转染试剂	Invitrogen	--
基因表达检测	逆转录试剂盒	Takara	--
7900 HT 实时荧光定量 PCR 仪	Applied Biosystems	--
Western blot	蛋白提取试剂盒	Elabscience	E-BC-E002
BCA 蛋白定量试剂盒	Beyotime	P0012S
RhoC 抗体	Abcam	ab180785
Collagen I 抗体	Abcam	ab260043
α-SMA 抗体	Abcam	ab5694
ROCK2 抗体	Abcam	ab125025
MLC-2 抗体	Cell Signaling Technology	3672
p-MLC-2 抗体	Cell Signaling Technology	3671
GAPDH 抗体	Abcam	ab9485
二抗	Abcam	ab6721
化学发光试剂	Beyotime	P0018M
细胞增殖检测	CCK-8 试剂盒	Sigma-Aldrich	--
CCK-8 溶液	上海 Acmec 生化科技有限公司	CA1210-5000
细胞凋亡检测	Annexin V-FITC/PI 试剂盒	YEASEN Biotech	--
双荧光素酶报告基因实验	双荧光素酶报告基因试剂盒	江苏凯基生物技术股份有限公司	KGAF040
细胞培养	LX-2 细胞系	Pricella	CL-0560
双荧光素酶报告基因实验	293T 细胞系	北京北纳创联生物技术研究院	BNCC353535

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养

Gibco

Gibco

Gibco

细胞培养诱导

转化生长因子-β1

Sigma-Aldrich

H8541

细胞转染

Lipofectamine 2000 转染试剂

Invitrogen

基因表达检测

逆转录试剂盒

Takara

7900 HT 实时荧光定量 PCR 仪

Applied Biosystems

Western blot

蛋白提取试剂盒

Elabscience

E-BC-E002

BCA 蛋白定量试剂盒

Beyotime

P0012S

RhoC 抗体

Abcam

ab180785

Collagen I 抗体

Abcam

ab260043

α-SMA 抗体

Abcam

ab5694

ROCK2 抗体

Abcam

ab125025

MLC-2 抗体

Cell Signaling Technology

3672

p-MLC-2 抗体

Cell Signaling Technology

3671

GAPDH 抗体

Abcam

ab9485

二抗

Abcam

ab6721

化学发光试剂

Beyotime

P0018M

细胞增殖检测

CCK-8 试剂盒

Sigma-Aldrich

CCK-8 溶液

上海 Acmec 生化科技有限公司

CA1210-5000

细胞凋亡检测

Annexin V-FITC/PI 试剂盒

YEASEN Biotech

双荧光素酶报告基因实验

双荧光素酶报告基因试剂盒

江苏凯基生物技术股份有限公司

KGAF040

细胞培养

LX-2 细胞系

Pricella

CL-0560

双荧光素酶报告基因实验

293T 细胞系

北京北纳创联生物技术研究院

BNCC353535

环节	核对要点
细胞培养与活化	LX-2 细胞培养条件（DMEM + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素，37°C，5% CO2），TGF-β1 诱导浓度（5 ng/mL）和时间（48 h），活化的形态学确认。阅读提示：Materials and methods 中 'Experimental materials' 和 'Cell grouping and corresponding treatments'
细胞转染与分组	转染试剂（Lipofectamine 2000）、miR-372-3p mimic 浓度（50 nM）、oe-RhoC 载体量（2 μg）、转染时间（48 h），分组设置及对照。阅读提示：Materials and methods 中 'Cell grouping and corresponding treatments'
基因表达检测	RT-qPCR 引物序列（表1）、内参（U6、GAPDH）、PCR 反应条件（95°C 5 min；94°C 40 s，55°C 40 s，70°C 1 min，32 cycles；72°C 20 min），2^-ΔΔCt 法计算相对表达。阅读提示：Materials and methods 中 'RT-qPCR' 和 Table 1
蛋白表达检测	蛋白提取试剂盒、BCA 定量、SDS-PAGE 上样量（20 μg/孔）、PVDF 膜、抗体稀释比例、内参 GAPDH。阅读提示：Materials and methods 中 'Western blot'
细胞功能检测	CCK-8 检测细胞密度（5×10^3 细胞/孔）和检测时间点（24、48、72、96 h），凋亡检测细胞密度（5×10^5 细胞/mL）及 Annexin V-FITC/PI 用量和孵育时间（10 min）。阅读提示：Materials and methods 中 'Cell counting kit-8 (CCK-8) assay' 和 'Annexin V-FITC/PI double staining'
靶向验证	生物信息学预测网站（Starbase）、RhoC-WT 和 RhoC-MUT 质粒构建，共转染到 293T 细胞，48 小时后检测荧光素酶活性。阅读提示：Materials and methods 中 'Dual-luciferase reporter assay'
统计分析	所有细胞实验独立重复 3 次，数据以均值±标准差表示，多组比较用单因素方差分析（one-way ANOVA）和 Tukey 事后检验，双组比较用 t 检验，p<0.05 认为有统计学意义。阅读提示：Materials and methods 中 'Statistical analysis'

环节

核对要点

细胞培养与活化

LX-2 细胞培养条件（DMEM + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素，37°C，5% CO2），TGF-β1 诱导浓度（5 ng/mL）和时间（48 h），活化的形态学确认。

阅读提示：Materials and methods 中 'Experimental materials' 和 'Cell grouping and corresponding treatments'

细胞转染与分组

转染试剂（Lipofectamine 2000）、miR-372-3p mimic 浓度（50 nM）、oe-RhoC 载体量（2 μg）、转染时间（48 h），分组设置及对照。

阅读提示：Materials and methods 中 'Cell grouping and corresponding treatments'

基因表达检测

RT-qPCR 引物序列（表1）、内参（U6、GAPDH）、PCR 反应条件（95°C 5 min；94°C 40 s，55°C 40 s，70°C 1 min，32 cycles；72°C 20 min），2^-ΔΔCt 法计算相对表达。

阅读提示：Materials and methods 中 'RT-qPCR' 和 Table 1

蛋白表达检测

蛋白提取试剂盒、BCA 定量、SDS-PAGE 上样量（20 μg/孔）、PVDF 膜、抗体稀释比例、内参 GAPDH。

阅读提示：Materials and methods 中 'Western blot'

细胞功能检测

CCK-8 检测细胞密度（5×10^3 细胞/孔）和检测时间点（24、48、72、96 h），凋亡检测细胞密度（5×10^5 细胞/mL）及 Annexin V-FITC/PI 用量和孵育时间（10 min）。

阅读提示：Materials and methods 中 'Cell counting kit-8 (CCK-8) assay' 和 'Annexin V-FITC/PI double staining'

靶向验证

生物信息学预测网站（Starbase）、RhoC-WT 和 RhoC-MUT 质粒构建，共转染到 293T 细胞，48 小时后检测荧光素酶活性。

阅读提示：Materials and methods 中 'Dual-luciferase reporter assay'

统计分析

所有细胞实验独立重复 3 次，数据以均值±标准差表示，多组比较用单因素方差分析（one-way ANOVA）和 Tukey 事后检验，双组比较用 t 检验，p<0.05 认为有统计学意义。

阅读提示：Materials and methods 中 'Statistical analysis'

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