AP对猪链球菌的抗菌活性测定
测定AP对猪链球菌的最小抑菌浓度（MIC）及不同浓度下对细菌生长的影响
采用微量肉汤稀释法测定AP对猪链球菌HA9801的MIC，并绘制不同浓度AP下的生长动力学曲线。
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穿心莲内酯通过质子动力恢复猪链球菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性
Andrographolide reverses the susceptibility of Streptococcus suis to aminoglycoside antibiotics by proton motive force.
实验完整度
高研究包含体外抗菌活性、机制验证（PMF测量、代谢组学）及小鼠体内感染模型等多个证据层级，且进行了功能验证和机制研究。
主要模型
猪链球菌HA9801 小鼠感染模型（BALB/c小鼠） 其他临床分离株（大肠杆菌O157:H7、支气管炎博德特氏菌QD1、无乳链球菌LY016、副猪嗜血杆菌HN05）
重点核对
AP浓度：250 µg/mL（MIC） 联合用药浓度：TOB 5 µg/mL + AP 125 µg/mL，SM 160 µg/mL + AP 62.5 µg/mL BCECF-AM探针测定ΔpH 非靶向代谢组学（UPLC-LTQ XL） 小鼠感染模型：20 mg/kg AP + 10 mg/kg TOB
摘要
背景：全球多重耐药菌的不断增多显著削弱了传统抗生素的疗效。多重耐药猪链球菌（S. suis）是一种能够感染猪和人类的病原体，已被确定为严重威胁，导致严重脑膜炎和快速死亡。为此，研究人员越来越关注草药化合物作为非传统抗菌剂，其既能抑制细菌生长，又能最大限度降低耐药性发展的风险。本研究探讨穿心莲内酯（AP）恢复猪链球菌对氨基糖苷类抗生素敏感性的机制。方法：使用2',7'-双-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素（BCCF-AM）探针评估猪链球菌胞内ΔpH，以考察AP处理后质子动力（PMF）的变化。采用非靶向代谢组学确认AP暴露后猪链球菌代谢谱的变化。最后，利用体内感染模型评估AP与抗生素联合的治疗效果。结果：大量体外实验表明，AP显著增强氨基糖苷类抗生素对多种病原体（包括猪链球菌）的活性。进一步研究表明，细菌死亡源于AP介导的猪链球菌PMF上调，从而增强细胞对妥布霉素（TOB）的摄取。此外，AP显著上调猪链球菌的丙酮酸代谢，加速三羧酸（TCA）循环，并增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的产生。这种代谢转变进一步增强了PMF。AP与氨基糖苷类抗生素联合使用显著降低了小鼠各器官的细菌载量和器官病变。结论：AP有望成为氨基糖苷类抗生素的佐剂，用于对抗猪链球菌引起的感染，为临床应用提供理论基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 穿心莲内酯（AP）是否以及如何恢复猪链球菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性？
- 核心机制
- AP通过提高猪链球菌的胞内pH，增强质子动力（PMF），并上调丙酮酸代谢、加速三羧酸循环、增加NADH产生，从而促进氨基糖苷类抗生素（如妥布霉素）的摄取，进而发挥杀菌作用。
- 主要证据
- 体外实验显示AP与氨基糖苷类抗生素联用具有协同抗菌作用，并降低耐药性发展；BCECF-AM荧光探针显示AP剂量依赖性升高胞内pH；代谢组学显示丙酮酸代谢通路显著上调；小鼠感染模型显示联合用药降低细菌载量和器官病理损伤。
- 研究意义
- AP有望作为氨基糖苷类抗生素的佐剂，用于治疗猪链球菌感染，为临床应用提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
联合抗菌效果评估
评估AP与氨基糖苷类抗生素联合使用对多种耐药菌的协同抗菌作用
通过棋盘稀释法测定联合用药的FIC指数，并绘制杀菌曲线。
耐药性发展评估
评估AP是否减缓猪链球菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性发展
连续传代培养猪链球菌，在亚抑菌浓度的抗生素存在下，是否添加AP，每五代测定MIC。
生物膜抑制和清除实验
评估AP与氨基糖苷类抗生素联用对猪链球菌生物膜形成和成熟生物膜的影响
进行生物膜抑制和清除实验，通过结晶紫染色定量生物膜量，并用SEM观察生物膜结构。
PMF机制研究
探究AP是否通过影响PMF来增强氨基糖苷类抗生素的摄取
通过调节培养基pH、使用BCECF-AM探针检测ΔpH、以及分析细菌游动能力来评估PMF变化；并测定胞内TOB含量。
非靶向代谢组学分析
解析AP处理后猪链球菌的代谢变化，探索其增强PMF的分子机制
使用液相色谱-质谱联用进行非靶向代谢组学分析，并鉴定差异代谢物和相关通路。
体内药效评估
验证AP与TOB联合对猪链球菌感染小鼠的治疗效果和安全性
将猪链球菌腹腔注射BALB/c小鼠，分组处理，测定器官细菌载量和组织病理学变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
耐药性评估
安全性评价
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 胰蛋白胨大豆肉汤 | -- | -- |
| Luria-Bertani肉汤 | -- | -- | |
| 药物处理 | 穿心莲内酯 | Aladdin | -- |
| 妥布霉素 | -- | -- | |
| 硫酸链霉素 | -- | -- | |
| 阿米卡星 | -- | -- | |
| 卡那霉素 | -- | -- | |
| 大观霉素 | -- | -- | |
| 庆大霉素 | -- | -- | |
| 硫酸新霉素 | -- | -- | |
| pH测定 | BCECF-AM荧光探针 | Yi Sheng Biotechnology Co., LTD | -- |
| 缓冲液 | HEPES缓冲液 | Beyotime | -- |
| 代谢组学 | 赛默飞超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher | -- |
| LTQ XL质谱仪 | Thermo Fisher | -- | |
| 代谢物含量测定 | 辅酶I NAD(H)含量检测试剂盒 | -- | -- |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Procell | PM150110 |
| 牛血清 | Thermo Fisher | 16170060 | |
| 细胞毒性检测 | 细胞增殖-毒性检测试剂盒 | Severn Innovation Beijing Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 生物膜观察 | 扫描电子显微镜 | JSM-5610LV, Japan | -- |
| 溅射镀膜仪 | -- | -- | |
| 生化分析 | 刚果红溶液 | Aladdin | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌培养与抗菌活性测定 | 菌株来源；培养基类型（TSB或LB）；AP和抗生素的MIC值；AP浓度（如250 µg/mL）；联合用药的FIC指数。 阅读提示：Materials and methods - Strains and culture conditions; Results - Antibacterial activity of AP; Table 1 |
| 耐药性发展实验 | AP浓度（31.25 µg/mL）；抗生素浓度（亚抑菌浓度）；传代代数（30代）；重复次数。 阅读提示：Materials and methods - Analysis of resistance development; Results - AP enhances... (Fig. 2C) |
| 生物膜实验 | 细菌浓度（106 CFU/mL）；药物浓度（TOB 5 µg/mL或SM 160 µg/mL，AP 125或62.5 µg/mL）；孵育时间（24h）；结晶紫染色条件。 阅读提示：Materials and methods - Biofilm inhibition assay; Figure 3 |
| PMF机制研究 | 培养基pH（5.0-8.0）；BCECF-AM浓度（10 µM）；荧光测量参数（激发/发射500/522 nm）；游动实验细菌（E. coli）和药物浓度。 阅读提示：Materials and methods - Effect of pH on combined bacterial inhibition; Determination of ΔpH by BCECF-AM; Swimming motility assay |
| 代谢组学分析 | AP处理浓度（亚MIC）；样品制备细节；LC-MS参数；差异代谢物筛选标准（FC>2, VIP>1, p<0.001）。 阅读提示：Materials and methods - Liquid chromatograph mass spectrometer metabolomics; Results - Non-targeted metabolomics analysis |
| 体内药效评估 | 小鼠品系和年龄；感染剂量（108 CFU/mL, 100 µL）；给药方案（剂量、频率、时长）；器官细菌载量测定方法。 阅读提示：Materials and methods - Mouse anti-infection assay; Figure 6 |