小鼠肝脏sEVs提取与表征
提取不同年龄小鼠肝脏组织中的sEVs并验证其特性
从1周、6周、6月、12月、14月龄小鼠肝脏组织中提取sEVs，通过TEM、NTA和Western blot验证sEVs的形态、大小和标志物。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过小细胞外囊泡递送miR-23b-3p促进细胞衰老和异常脂质代谢
Delivering miR-23b-3p by small extracellular vesicles to promote cell senescence and aberrant lipid metabolism.
实验完整度
高证据层级涵盖组学分析、体外功能验证、机制验证（双荧光素酶报告实验）及体内动物模型和临床样本验证。
主要模型
AML12小鼠肝细胞系 HEK-293T细胞系 C57BL/6J小鼠 家族性高胆固醇血症患者血液样本
重点核对
不同年龄小鼠：1周、6周、6月、12月、14月 体外衰老诱导：20μM依托泊苷处理AML12细胞 miR-23b-3p mimics/inhibitor转染浓度 AAV8-mmu-miR-23b-3p尾静脉注射小鼠模型 患者分组：健康对照、纯合FH、杂合FH
摘要
背景：衰老是影响生物体内大多数器官的自然过程。然而，肝脏因其强大的再生和代谢能力在维持生物体稳态中起着关键作用。尽管如此，肝脏也会受到衰老的影响，这可能导致一系列代谢紊乱。细胞外囊泡及其传递的信号是衰老研究领域中一个重要的兴趣点。然而，从细胞外囊泡的角度对肝脏衰老的研究仍然相对有限。结果：在本研究中，我们提取了不同年龄小鼠的肝组织小细胞外囊泡（sEVs），并进行转录组和蛋白质组分析，以研究衰老相关的分泌表型（SASP）及其机制。老年组的sEVs富含miR-23b-3p，该miRNA在诱导衰老细胞的sEVs中含量丰富，并通过靶向肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（Tnfaip3）促进细胞衰老。将表达miR-23b-3p的腺相关病毒（AAV）注射到小鼠体内后，实验组小鼠的肝脏表现出比对照组更明显的炎症反应。此外，我们发现在家族性高胆固醇血症患者血液来源的sEVs中，miR-23b-3p水平升高。结论：我们的研究结果表明，miR-23b-3p在肝脏衰老中发挥关键作用，并与异常脂质代谢相关。肝脏细胞外囊泡中miR-23b-3p的上调可能作为衰老和代谢紊乱的潜在生物标志物。靶向miR-23b-3p可能为改善年龄相关的肝功能障碍及相关代谢异常提供新的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肝脏衰老过程中细胞外囊泡（sEVs）的成分变化及其在衰老和脂质代谢异常中的作用机制？
- 核心机制
- miR-23b-3p通过靶向Tnfaip3 mRNA的3'UTR区域，抑制Tnfaip3表达，进而促进细胞衰老和细胞周期阻滞。
- 主要证据
- 小鼠肝脏sEVs转录组/蛋白质组分析发现miR-23b-3p富集；体外双荧光素酶报告实验和Western blot验证miR-23b-3p直接靶向抑制Tnfaip3；流式细胞术和SA-β-gal染色显示miR-23b-3p促进细胞衰老；AAV小鼠模型证明miR-23b-3p在体内诱导肝脏炎症和轻度MAFLD病变；FH患者血液EVs中miR-23b-3p水平升高。
- 研究意义
- 研究揭示miR-23b-3p在肝脏衰老和脂质代谢异常中的关键作用，可能作为衰老和代谢紊乱的生物标志物，并为年龄相关肝功能障碍的治疗提供新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
sEVs转录组与蛋白质组分析
分析不同年龄小鼠肝脏sEVs中miRNA和蛋白质表达差异，筛选与衰老相关的候选分子。
对五个年龄组小鼠肝脏sEVs进行RNA-seq和蛋白质组学分析，通过k-means聚类和KEGG通路富集分析筛选与衰老相关的miRNA和蛋白质。
体外衰老细胞模型建立与验证
建立诱导衰老的细胞模型，并验证其衰老表型。
使用依托泊苷处理AML12细胞诱导衰老，通过SA-β-gal染色、p21WAF1/Cip1表达和γ-H2A.X检测验证衰老表型。
miR-23b-3p靶向Tnfaip3验证
验证miR-23b-3p与Tnfaip3的直接靶向关系。
通过双荧光素酶报告实验、RT-qPCR和Western blot验证miR-23b-3p对Tnfaip3表达的调控作用。
miR-23b-3p促进细胞衰老验证
验证miR-23b-3p对细胞衰老的促进作用。
将miR-23b-3p mimics或inhibitor转染至AML12细胞，通过流式细胞术、SA-β-gal染色和p21Waf1/Cip1表达检测细胞衰老情况。
体内验证miR-23b-3p对肝脏衰老和脂质代谢的影响
在动物水平验证miR-23b-3p对肝脏衰老和脂质代谢的影响。
将AAV8-mmu-miR-23b-3p通过尾静脉注射至小鼠，通过心脏超声、HE染色、IHC和ELISA检测肝脏炎症和脂质代谢相关指标。
临床样本验证
验证FH患者血液EVs中miR-23b-3p的表达水平。
收集健康对照和FH患者血液，提取EVs，通过RT-qPCR检测miR-23b-3p水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| sEVs分离 | Miltenyi人肿瘤组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
| Exosupur® 分离柱 | Echobiotech | -- | |
| Amicon® Ultra 超滤管 | Merck | -- | |
| sEVs表征 | ZetaView PMX 110 纳米颗粒分析仪 | Particle Metrix | -- |
| NanoSight LM10 纳米颗粒分析仪 | -- | -- | |
| 日立H-7650透射电子显微镜 | Hitachi | -- | |
| RNA提取 | miRNeasy血清/血浆高级试剂盒 | Qiagen | 217204 |
| RT-qPCR | PrimeScript™ RT 试剂盒（Perfect Real Time） | TAKARA | RR037A |
| miRNA第一链cDNA合成试剂盒（茎环法） | Vazyme | MR101 | |
| miRNA通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | MQ101 | |
| RNA-seq | QIAseq miRNA文库构建试剂盒 | Qiagen | -- |
| 蛋白质组学 | Pierce™ BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 |
| 质谱分析 | Q Exactive HF-X 质谱仪 | Thermo Fisher | -- |
| Nanospray Flex™（ESI）离子源 | Thermo Fisher | -- | |
| 双荧光素酶报告实验 | pmirGLO双荧光素酶miRNA靶标表达载体 | Promega | E1330 |
| Lipofectamine® 3000 转染试剂 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Dual-Glo® 荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| 细胞培养与处理 | 依托泊苷（VP-16） | MedChemExpress | HY-13629 |
| 细胞衰老染色 | 衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Beyotime | C0602 |
| Western blot | CD63抗体 | Santa Cruz | sc-5275 |
| CD9抗体 | Proteintech | 60232-I-Ig | |
| TSG101抗体 | Beyotime | AF8259 | |
| Calnexin抗体 | Promega | 10427-2-AP | |
| p21抗体 | Abcam | ab188224 | |
| Calnexin抗体 | Abcam | ab133615 | |
| Flotillin-1抗体 | Cell Signaling Technology | 18634 | |
| β-Actin抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| A20/Tnfaip3抗体 | Santa Cruz | sc-166692 | |
| 磷酸化组蛋白H2A.X（Ser139）抗体 | Cell Signaling Technology | 2577 | |
| ELISA | 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | BD | -- |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | BD | -- | |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | ABclonal | -- | |
| 肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒 | ABclonal | -- | |
| 小鼠单核细胞趋化蛋白1 ELISA试剂盒 | ABclonal | -- | |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | Beyotime | C1052 |
| 核糖核酸酶A | Beyotime | ST578 | |
| CytoFLEX LX-322 流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 免疫荧光 | 磷酸化组蛋白H2A.X（Ser139）（20E3）XP® 抗体 | Cell Signaling Technology | 7631 |
| Alexa Fluor™ 488 偶联的山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗 | Invitrogen | A-11008 | |
| 徕卡DMi8显微镜 | Leica | -- | |
| 动物实验 | AAV8-mmu-miR-23b-3p腺相关病毒 | -- | -- |
| 高脂饮食（60% HFD） | Research Diets | D12492 | |
| Vinno 8 成像系统 | -- | -- | |
| 组织病理 | BA210显微镜 | Motic | -- |
| VS200-BU全自动切片扫描仪 | Olympus | -- | |
| 细胞培养 | AML12细胞系 | Procell | CL-0602 |
| DMEM细胞培养基 | -- | -- | |
| 热灭活胎牛血清 | -- | -- | |
| 去除细胞外囊泡的胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞转染 | miRNA模拟物 | Genepharma | B02003 |
| miRNA抑制剂 | Genepharma | B03001 | |
| miRNA对照 | Genepharma | B04003 | |
| miRNA对照 | Genepharma | B04002 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| sEVs分离与表征 | 组织来源（小鼠年龄、数量）、分离方法（超速离心+尺寸排阻色谱）、表征工具（TEM、NTA、Western blot抗体） 阅读提示：Methods: Separation of small extracellular vesicles (sEVS)、sEVs for characterization |
| 转录组与蛋白质组分析 | RNA-seq和蛋白质组学分析的平台、差异表达筛选阈值（FDR<0.01, FC>1.5）、聚类方法和通路分析工具 阅读提示：Methods: miRNA analysis、Protein extraction and proteomic analysis |
| 体外衰老模型 | 依托泊苷浓度（20μM）、处理时间（3小时/天）、细胞系（AML12）、衰老鉴定指标（SA-β-gal、p21、γ-H2A.X） 阅读提示：Methods: Senescent cell model construction and senescence β-galactosidase staining |
| miR-23b-3p靶向验证 | miR-23b-3p mimics/inhibitor浓度、转染试剂和时间、双荧光素酶报告实验构建、Tnfaip3检测方法 阅读提示：Methods: Plasmids construction、Dual-luciferase reporter assay、Western blot |
| 体内动物模型 | AAV注射剂量和途径、小鼠品系和性别、高脂饮食配方和时间、心脏超声和肝脏组织学评估方法 阅读提示：Methods: Animal model、Mice echocardiography、Hematoxylin and Eosin (HE) staining |
| 临床样本验证 | FH患者诊断标准、样本采集和处理流程、EVs提取和miR-23b-3p检测方法 阅读提示：Methods: Human subjects |