临床样本验证MTHFD2表达和预后价值
验证MTHFD2在ESCC组织和细胞系中的表达水平及其与临床病理特征和预后的关系。
使用TCGA-ESCA和GEO数据库进行生物信息学分析，并在80对临床ESCC及癌旁组织中进行免疫组化验证，同时在ESCC细胞系（TE1、KYSE30、KYSE410、KYSE150、KYSE510、Het-1A）中通过WB和qPCR检测MTHFD2表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
MTHFD2通过m6A修饰介导的上调和PEBP1-RAF1相互作用的调节促进食管鳞状细胞癌进展
MTHFD2 promotes esophageal squamous cell carcinoma progression via m6A modification‑mediated upregulation and modulation of the PEBP1‑RAF1 interaction.
实验完整度
高包含临床样本验证、体外细胞功能实验、体内动物模型、机制研究（MeRIP、RNA稳定性、Co-IP、RNA pull-down）等多个独立证据层级。
主要模型
ESCC细胞系KYSE30和KYSE410 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型 80对ESCC患者肿瘤及癌旁组织样本
重点核对
MTHFD2在ESCC组织和细胞系中的表达水平（IHC、WB、qPCR） METTL3和IGF2BP2对MTHFD2 mRNA稳定性的影响（RNA稳定性实验、双荧光素酶报告基因实验） MTHFD2敲低对细胞活力、集落形成、侵袭的影响（CCK-8、集落形成、Transwell） MTHFD2敲低对体内肿瘤生长的影响（裸鼠皮下成瘤模型） MTHFD2与PEBP1的相互作用及其对PEBP1-RAF1结合的调节（Co-IP）
摘要
一碳代谢在癌症进展中起着重要作用。亚甲基四氢叶酸脱氢酶2（MTHFD2）是一碳代谢中的线粒体酶，在多种癌症类型中失调。然而，MTHFD2在食管鳞状细胞癌（ESCC）中的确切作用和机制仍不清楚。本研究揭示了MTHFD2促进ESCC发病机制的多方面机制。生物信息学分析显示，MTHFD2在ESCC肿瘤组织中显著上调，这与晚期疾病阶段和患者预后不良相关。在临床样本中验证了这些发现，通过免疫组织化学、逆转录定量PCR和蛋白质印迹证实了MTHFD2的过表达。敲低MTHFD2抑制了ESCC细胞的活力、集落形成、侵袭和体内肿瘤生长，表明其致癌潜力。机制上，本研究阐明了一个涉及N6-甲基腺苷修饰和MTHFD2 mRNA稳定性的新型调控轴。具体而言，甲基转移酶样3（METTL3）和胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IGF2BP2）被确定为m6A依赖性稳定MTHFD2 mRNA的关键介质，促使其在ESCC中高表达。此外，发现MTHFD2通过调节磷脂酰乙醇胺结合蛋白1（PEBP1）和raf-1原癌基因（RAF1）之间的相互作用来激活PI3K/AKT和ERK信号通路。这种调节通过MTHFD2直接结合PEBP1实现，破坏了PEBP1对RAF1的抑制作用，促进下游通路激活。MTHFD2的致癌功能在PEBP1敲低后减弱，强调了MTHFD2-PEBP1轴在ESCC进展中的作用。总之，本研究揭示了涉及m6A修饰和MTHFD2-PEBP1轴的新型调控机制，为靶向MTHFD2治疗ESCC提供了潜在的治疗途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MTHFD2在食管鳞状细胞癌中的表达、功能及调控机制尚不清楚，本研究旨在探究其在ESCC进展中的作用及潜在机制。
- 核心机制
- METTL3和IGF2BP2通过m6A修饰稳定MTHFD2 mRNA，上调MTHFD2表达；MTHFD2与PEBP1结合，破坏PEBP1对RAF1的抑制作用，从而激活PI3K/AKT和ERK信号通路。
- 主要证据
- 临床样本和组织芯片显示MTHFD2高表达且与不良预后相关；体外敲低MTHFD2抑制细胞增殖、侵袭，体内抑制肿瘤生长；机制实验证实METTL3/IGF2BP2调控MTHFD2 mRNA稳定性，Co-IP显示MTHFD2结合PEBP1并调节PEBP1-RAF1相互作用，PEBP1敲低可部分逆转MTHFD2敲低的下游效应。
- 研究意义
- 本研究揭示了MTHFD2在ESCC中的新型调控机制，提示靶向MTHFD2可能为ESCC提供潜在的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
研究m6A修饰对MTHFD2表达和稳定性的调控
探究METTL3和IGF2BP2是否通过m6A修饰调控MTHFD2 mRNA稳定性和表达。
在KYSE30和KYSE410细胞中敲低METTL3和IGF2BP2，通过RT-qPCR、WB检测MTHFD2表达；MeRIP-qPCR验证m6A修饰；RNA稳定性实验和双荧光素酶报告基因实验检测mRNA稳定性；RNA pull-down验证IGF2BP2与MTHFD2 mRNA的结合。
评估MTHFD2敲低对ESCC细胞功能的影响
验证MTHFD2对ESCC细胞活力、增殖和侵袭的调控作用。
在KYSE30和KYSE410细胞中稳定敲低MTHFD2（shRNA），通过CCK-8、集落形成和Transwell实验检测细胞活力、增殖和侵袭能力。
评估MTHFD2敲低对体内肿瘤生长的影响
验证MTHFD2在体内对ESCC肿瘤生长的影响。
使用KYSE30细胞（稳定敲低MTHFD2或对照）皮下注射至6周龄雌性BALB/c裸鼠，监测肿瘤生长，六周后处死，进行IHC染色评估MTHFD2和Ki67表达。
验证MTHFD2对PI3K/AKT和ERK信号通路的影响及机制
探究MTHFD2是否通过调节PEBP1-RAF1相互作用激活下游信号通路。
在KYSE30和KYSE410细胞中敲低MTHFD2，通过WB检测p-AKT、p-ERK水平；Co-IP验证MTHFD2与PEBP1、PEBP1与RAF1的相互作用；在MTHFD2敲低后过表达MTHFD2，检测通路蛋白水平变化；双敲MTHFD2和PEBP1，检测细胞功能变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Wuhan Pricella Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 胎牛血清 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| RNA干扰和慢病毒生产 | shRNA慢病毒载体 | Shanghai GeneChem Co., Ltd. | -- |
| RNA干扰 | 小干扰RNA | GeneChem | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 7500实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| Western blot | MTHFD2抗体 | Proteintech Group, Inc. | 12270-1-AP |
| METTL14抗体 | Proteintech Group, Inc. | 26158-1-AP | |
| IGF2BP2抗体 | Proteintech Group, Inc. | 11601-1-AP | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Cell Signaling Technology, Inc. | -- | |
| 免疫组化 | 牛血清白蛋白 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 37520 |
| MTHFD2一抗 | Proteintech Group, Inc. | 12270-1-AP | |
| 生物素标记的二抗 | Proteintech Group, Inc. | SA00004-2 | |
| MeRIP-qPCR | Protein A/G磁珠 | BersinBio | Bes5203-1 |
| 双荧光素酶报告基因实验 | pmirGLO报告质粒 | Promega Corporation | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega Corporation | -- | |
| 免疫共沉淀 | Pierce IP裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| RNA pull-down | Ribo RNAmax-T7生物素标记RNA合成试剂盒 | RiboBio | C11002-2 |
| RNA pull-down试剂盒 | BersinBio | Bes5102 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Biosharp | -- |
| Transwell侵袭实验 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| Matrigel基质胶 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | ESCC细胞系（TE1、KYSE30、KYSE410、KYSE150、KYSE510）和Het-1A细胞来源为武汉普赛诺生物科技有限公司；培养基为RPMI-1640添加10%胎牛血清，37°C、5% CO2。 阅读提示：Materials and methods, Cell culture |
| RNA干扰 | shRNA序列（shMTHFD2#1、#2，shNC）及siPEBP1序列，转染试剂Lipofectamine 2000，siRNA浓度20 μM，转染时间48小时。 阅读提示：Materials and methods, RNA interference, lentivirus production and infection |
| RT-qPCR | RNA提取使用TRIzol，逆转录使用PrimeScript RT试剂盒，qPCR使用SYBR Premix Ex Taq II；引物序列见表SI。 阅读提示：Materials and methods, Reverse transcription quantitative PCR |
| Western blot | 一抗：MTHFD2、METTL14、IGF2BP2稀释比1:1000，二抗1:2000。 阅读提示：Materials and methods, Western blot |
| 动物实验 | 6周龄雌性BALB/c裸鼠，每组6只；每只皮下注射5×10^6个KYSE30细胞；饲养条件：22-25°C，50-60%湿度，12小时光/暗周期。 阅读提示：Materials and methods, Subcutaneous tumor formation in nude mice |