表达分析
证实 SF3A3 和 STIL 在 HCC 组织和细胞中的表达水平及相关性。
利用 UALCAN 数据库分析 SF3A3 和 STIL 的转录和蛋白表达及与预后的关系；收集 30 例 HCC 患者的肿瘤和癌旁组织，使用 RT-qPCR 检测表达；在 HCC 细胞系 Hep3B、Huh7 和正常肝细胞系 THLE-2 中检测表达。
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STIL 与 FOXM1 的相互作用调控肝细胞癌发展中的 SF3A3 转录
Interaction of STIL with FOXM1 regulates SF3A3 transcription in the hepatocellular carcinoma development.
实验完整度
高包含临床组织样本表达分析、体外细胞功能学验证（增殖、凋亡、迁移、侵袭）、分子机制验证（co-IP、ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因）及体内异种移植模型验证，证据层次覆盖表达、功能和机制。
主要模型
Hep3B 和 Huh7 人肝癌细胞系 THLE-2 正常肝细胞系 BALB/c 裸鼠异种移植瘤模型 HCC 患者肿瘤及癌旁组织
重点核对
SF3A3 和 STIL 在 HCC 组织和细胞中的表达（RT-qPCR） 敲低 SF3A3 或 STIL 后细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的变化（EdU、集落形成、流式、划痕、Transwell） STIL 与 FOXM1 的相互作用及对 FOXM1 结合 SF3A3 启动子的影响（co-IP、ChIP-qPCR） STIL 和 FOXM1 对 SF3A3 启动子活性的影响（双荧光素酶报告基因） 体内异种移植瘤的生长变化及 Ki67、GPC3、p53 的表达（免疫组化）
摘要
背景：SF3A3 的失调与许多癌症的发展有关。在此，我们研究了 SF3A3 在肝细胞癌（HCC）中的功能作用。方法：使用 RT-qPCR 检测 HCC 组织和细胞系中 SF3A3 的表达。通过 EdU、集落形成、流式细胞术、伤口愈合和 Transwell 侵袭实验评估 SF3A3 下调后 HCC 细胞恶性行为的变化。整合多个数据集以确定 SF3A3 的上游调节因子。通过 co-IP 实验探索 STIL 与 FOXM1 之间的结合关系，并通过 ChIP-qPCR 实验检测 STIL 和 FOXM1 对 FOXM1 在 SF3A3 启动子结合的影响。建立异种移植肿瘤模型以探索体内肿瘤的变化，并通过免疫组织化学检测肿瘤组织中 Ki67、GPC3 和 p53 的表达。结果：SF3A3 和 STIL 在 HCC 组织和细胞中过表达，下调 SF3A3 或 STIL 通过促进 p53 的表达抑制 HCC 细胞的恶性行为。STIL 与 FOXM1 的相互作用调节 HCC 细胞中 SF3A3 的表达。敲低 FOXM1 进一步增强了 STIL 缺失对 HCC 细胞的体外和体内抗肿瘤作用，而 SF3A3 过表达逆转了 STIL 缺失对 HCC 细胞体外和体内的影响。结论：我们的研究结果表明 STIL/FOXM1 通过激活 SF3A3 加速 HCC 发展，这凸显了 SF3A3 作为 HCC 有前景的预后标志物和治疗靶点的重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SF3A3 在 HCC 中的功能作用及其上游调控机制是什么？
- 核心机制
- STIL 与 FOXM1 相互作用，增强 FOXM1 与 SF3A3 启动子的结合，促进 SF3A3 转录，进而抑制 p53 表达，促进 HCC 发展。
- 主要证据
- 基于 UALCAN 数据库、GSE202853 数据集和 RT-qPCR 显示 SF3A3 和 STIL 在 HCC 中高表达；体外功能实验显示敲低它们抑制恶性行为；co-IP 证实 STIL-FOXM1 相互作用；ChIP-qPCR 和双荧光素酶实验显示其调控 SF3A3 转录；体内异种移植模型验证了 STIL/FOXM1-SF3A3 轴的作用。
- 研究意义
- 作者提出 SF3A3 是 HCC 有前景的预后标志物和治疗靶点，STIL/FOXM1 轴通过激活 SF3A3 促进 HCC 发展，为 HCC 治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能验证
评估敲低 SF3A3 或 STIL 对 HCC 细胞恶性行为的影响。
通过慢病毒介导的 shRNA 敲低 Hep3B 和 Huh7 细胞中的 SF3A3 或 STIL，使用 EdU、集落形成、流式细胞术、伤口愈合和 Transwell 侵袭实验检测增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的变化，并用 Western blot 检测 p53、Cleaved-caspase3、Bax、Ki67、GPC3 的表达。
机制探索
确定 STIL 与 FOXM1 的相互作用及其对 SF3A3 转录的调控。
通过 co-IP 验证 STIL 与 FOXM1 的结合；通过 ChIP-qPCR 检测敲低 STIL 和 FOXM1 对 FOXM1 结合 SF3A3 启动子的影响；通过双荧光素酶报告基因检测 SF3A3 启动子活性；通过 RT-qPCR 检测 SF3A3 mRNA 表达。
恢复实验
验证 SF3A3 是 STIL/FOXM1 复合物的下游效应因子。
在敲低 STIL 的基础上，同时敲低 FOXM1 或过表达 SF3A3，检测 HCC 细胞的恶性行为变化（增殖、凋亡、迁移、侵袭）。
体内验证
在体内模型中验证 STIL/FOXM1 对 SF3A3 的调控及对肿瘤生长的影响。
将不同处理的 Huh7 细胞皮下注射入 BALB/c 裸鼠，监测肿瘤体积和重量，通过 RT-qPCR 检测肿瘤组织中 SF3A3 mRNA 表达，并通过免疫组化检测 Ki67、GPC3 和 p53 蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 盐酸嘌呤霉素 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | ST551-10 mg | |
| 药物处理 | PFT-β | TargetMol | T3637 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Beyotime | R0016 |
| 反转录 | RevertAid RT反转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific Inc. | K1691 |
| RT-qPCR | BeyoFast SYBR Green qPCR预混液 | Beyotime | D7260-1 ml |
| 细胞增殖 | EdU细胞增殖检测试剂盒 | Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co., Ltd. | E607204 |
| 细胞凋亡 | Annexin V-FITC/PI试剂盒 | Beijing Solarbio Life Sciences Co., Ltd. | CA1020 |
| Transwell侵袭 | Transwell 24孔板 | Merck Millipore | -- |
| 基质胶 | -- | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | pGL4.2-basic-Luc报告质粒 | Promega Corporation | -- |
| pRL-TK内参质粒 | Beyotime | D2760-1 µg | |
| 双荧光素酶检测试剂盒 | Solarbio | D0011 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| FOXM1抗体 | Abcam | ab207298 | |
| STIL抗体 | Abcam | ab89314 | |
| p53抗体 | ProteinTech Group | 10442-1-AP | |
| Cleaved-caspase3抗体 | Cell Signaling Technologies | #9661 | |
| Bax抗体 | ProteinTech Group | 50599-2-Ig | |
| Ki67抗体 | Abcam | ab209897 | |
| GPC3抗体 | Abcam | ab95363 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technologies | 3683 S | |
| 山羊抗兔IgG-HRP二抗 | Abcam | ab205718 | |
| ChIP-qPCR | FOXM1抗体 | Abcam | ab245309 |
| 兔IgG同型对照 | GeneTex, Inc. | GTX35035 | |
| Co-IP | Protein A/G琼脂糖 | -- | -- |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich Chemical Company | -- |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | Cell Signaling Technologies | 9027 S |
| GPC3抗体 | Abcam | ab95363 | |
| p53抗体 | ProteinTech Group | 10442-1-AP | |
| 兔抗IgG H&L (HRP)二抗 | Abcam | ab6721 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad | -- |
| 细胞培养 | Hep3B | Procell | -- |
| Huh7 | Procell | -- | |
| THLE-2 | ATCC | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Vital River | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系（Hep3B、Huh7、THLE-2）来源、培养条件（DMEM、10% FBS、青霉素/链霉素、37°C、5% CO2）、嘌呤霉素筛选浓度（2 µg/mL，72h）、PFT-β处理浓度（23 µM）和时间（24h）。 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transfection |
| 体外功能实验 | 细胞增殖（EdU、集落形成）、凋亡（流式）、迁移（划痕）和侵袭（Transwell）的具体条件，如细胞数量、孵育时间、染色等。 阅读提示：Materials and methods: Cell proliferation analyses, Flow cytometry, Wound healing and transwell invasion assays |
| 分子机制实验 | 敲低STIL/FOXM1的shRNA序列、慢病毒感染条件、co-IP抗体及用量、ChIP-qPCR的抗体及用量、双荧光素酶报告基因的质粒和检测方法。 阅读提示：Materials and methods: RT-qPCR, ChIP-qPCR, Co-immunoprecipitation, Promoter reporters and dual-luciferase assay |
| 体内动物实验 | 小鼠品系（BALB/c nude）、周龄（4-week-old）、分组（8组）、细胞注射数量、肿瘤测量时间（每5天）、注射后观察时间（30天）。 阅读提示：Materials and methods: Lentiviral infection and xenograft mouse models |
| 统计方法 | 统计方法（paired t-test, one-way or two-way ANOVA with Tukey's correction）、显著水平（P<0.05）、数据表示（mean±SD）以及实验重复次数（三次）。 阅读提示：Materials and methods: Quantification and statistical analyses |