构建GFP-intron报告载体
构建分别表达R2蛋白和供体RNA的质粒，用于后续转染和活性评估。
通过PCR扩增合成片段，酶切载体骨架，利用Gibson组装连接R2蛋白ORF和供体相关片段至相应骨架，转化、筛选、测序验证并提取质粒。
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评估哺乳动物细胞中R2反转录转座子活性的实验方案
Protocol for evaluating the activity of R2 retrotransposons in mammalian cells.
实验完整度
中提供载体构建、转染、细胞分选、流式分析等明确实验步骤，但核心实验仅基于HEK293T细胞系，未涉及动物模型或患者样本等独立证据层级。
主要模型
HEK293T细胞
重点核对
R2蛋白表达质粒（pCAG-R2Tg-3xFlag）与供体质粒（mCherry-pCAG-donor(R2Tg)-GFP(intron)）的共转染 转染用量：各250 ng质粒DNA 转染试剂：Lipofectamine 3000（含P3000） 细胞分选：收集mCherry阳性细胞（前40%信号） 检测时间：转染后7天进行流式分析
摘要
R2反转录转座子可通过全RNA递送在靶位点插入基因，为下一代生物治疗提供新技术。本文报告了一种用于评估哺乳动物细胞中R2反转录转座子基因整合活性的实验方案。我们描述了分别表达R2蛋白和供体的载体的构建、脂质体转染过程以及流式细胞术。该方案提供了一个有用的报告系统，可用于评估其他新反转录转座子系统的活性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何评估哺乳动物细胞中R2反转录转座子的基因整合活性？
- 核心机制
- R2反转录转座子依赖RNA中间体的反转录，在靶位点（28S rDNA）位点特异性整合，通过反转录无内含子的GFP反义mRNA并整合至基因组，从而表达GFP。
- 主要证据
- 通过共转染R2蛋白表达质粒和供体质粒至HEK293T细胞，利用流式细胞术检测GFP阳性细胞比例；wt-R2Tg效率为2.25%，en-R2Tg效率为23.0%。
- 研究意义
- 该报告系统可用于评估新反转录转座子系统的活性，为开发基于R2的全RNA递送基因整合技术提供实验基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
瞬时转染HEK293T细胞
将报告质粒共转染至HEK293T细胞，以评估R2系统的活性。
用PDL包被24孔板，铺板HEK293T细胞，使用Lipofectamine 3000共转染R2蛋白表达质粒和供体质粒。
细胞分选与重铺
富集成功转染的细胞（mCherry+），以评估整合事件。
转染后1天，收集细胞，基于对照设门，用FACS分选mCherry阳性细胞（前40%信号），重铺至12孔板，培养6天。
流式细胞术分析
量化GFP阳性细胞比例，以评估基因整合效率。
转染后7天，收集细胞，以只转染供体质粒的细胞作为阴性对照设门，通过流式细胞仪采集数据，并使用FlowJo分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 胰酶-EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 转染 | Opti-MEM I减血清培养基 | Gibco | 31985088 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 | |
| 载体构建 | NEBuilder HiFi DNA组装预混液 | NEB | E2621L |
| Q5热启动高保真2×预混液 | NEB | M0494S | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| XmaI | NEB | R0180L | |
| BamHI-HF | NEB | R3136L | |
| NheI-HF | NEB | R3131L | |
| 细胞培养 | 多聚-D-赖氨酸 | Sigma | P6407 |
| 载体构建 | rCutSmart缓冲液 | NEB | B6004S |
| 细菌培养 | 胰蛋白胨 | Oxoid | LP0042 |
| 氯化钠 | Sinopharm Group | 10019318 | |
| 酵母提取物 | Oxoid | LP0021 | |
| 琼脂 | Dingguo Changsheng Company | DH010-1.1 | |
| 质粒提取 | TIANpure中量质粒提取试剂盒 | Tiangen | DP107–02 |
| DNA纯化 | Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒 | Zymo Research | D4008 |
| 细胞计数 | Countess II FL自动细胞计数仪 | Invitrogen | AMQAF1000 |
| 显微镜观察 | Leica DMi8显微镜 | Leica | -- |
| 细胞分选 | BD FACSAria Fusion流式细胞分选仪 | Beckman Coulter | -- |
| 流式分析 | BD LSRFortessa流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 克隆筛选 | Sanger测序 | -- | -- |
| 细胞培养 | 24孔板 | Corning | 3524 |
| 12孔板 | Corning | 3513 | |
| 细胞分选 | 5 mL圆底聚苯乙烯试管 | Falcon | 352003 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 载体构建 | PCR片段序列、酶切位点、Gibson组装条件、转化菌株、质粒提取 阅读提示：详见‘Construction of GFP-intron reporter vectors’部分 |
| 细胞培养与转染 | HEK293T细胞代数、汇合度约70%、PDL包被、质粒DNA量（各250ng）、转染试剂（Lipofectamine 3000） 阅读提示：详见‘Transient transfection’部分 |
| 细胞分选 | 转染后1天分选、mCherry阳性前40%信号、约50,000个细胞 阅读提示：详见‘Cell sorting and reseeding’部分 |
| 流式分析 | 转染后7天检测、阴性对照（仅转染供体质粒）设门、采集约30,000个细胞 阅读提示：详见‘Flow cytometric analysis’部分 |