人参皂苷Rg5通过Sirt1减少线粒体凋亡减轻辐射诱导的急性肺血管内皮损伤

Ginsenoside Rg5 alleviates radiation-induced acute lung vascular endothelium injury by reducing mitochondrial apoptosis via Sirt1.

作者信息Churong Li, Biao Zhao, Jing Xiong, Linjie Li, Dalong Pang, Keith Unger, Mira Jung, Jiahua Lyu, Hao Kuang, Long Liang, Tao Li, Long Chen, Hansong Bai
PMID40453348
发布时间2025-05
DOI10.1016/j.jgr.2025.01.004

实验完整度

包含体内小鼠模型(C57BL/6)和体外PPMECs模型,并进行了功能验证(凋亡、氧化应激、屏障功能)和机制验证(Mfn2乙酰化、Sirt1敲低/抑制)。

主要模型

C57BL/6小鼠 人原代肺微血管内皮细胞(PPMECs) HEK293T细胞(用于慢病毒包装)

重点核对

小鼠品系:C57BL/6,6周龄 人参皂苷Rg5给药剂量:30 mg/kg/天,腹腔注射,连续3天 照射剂量:小鼠10或20 Gy(1.2 Gy/min);细胞0、5或10 Gy(1 Gy/min) PPMECs来源:Procell(武汉),培养条件按推荐 Sirt1敲低慢病毒MOI=10 EX527浓度:10 μM

摘要

背景:人参皂苷Rg5具有强效的抗氧化、抗炎和细胞保护特性。本研究探讨了人参皂苷Rg5对辐射诱导的肺微血管内皮细胞(PMECs)损伤的保护作用及相关分子机制。材料与方法:采用C57BL/6小鼠进行体内研究,并以人原代PMECs(PPMECs)作为体外模型。对经或未经人参皂苷Rg5预处理的小鼠进行不同剂量的辐照。分析肺组织的组织病理学变化和内皮标志物的表达。体外,对经或未经人参皂苷Rg5预处理的PPMECs进行辐照,并分析凋亡、氧化应激、线粒体功能和内皮屏障完整性。结果:人参皂苷Rg5预处理在体内减轻了辐射诱导的急性肺损伤,保留了内皮细胞连接完整性,并维持了内皮屏障功能。体外,人参皂苷Rg5显著降低了IR诱导的PPMECs氧化应激、凋亡和线粒体功能障碍。人参皂苷Rg5通过Sirt1介导的去乙酰化抑制辐射诱导的Mfn2乙酰化和蛋白酶体降解,从而维持线粒体动力学和完整性。人参皂苷Rg5对线粒体和内皮紧密连接蛋白完整性及屏障功能的保护作用也依赖于Sirt1。结论:人参皂苷Rg5通过调节线粒体动力学和功能以及维持内皮屏障完整性,以Sirt1依赖的方式对辐射诱导的内皮损伤发挥保护作用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
人参皂苷Rg5能否减轻辐射诱导的肺微血管内皮细胞损伤及其分子机制是什么?
核心机制
人参皂苷Rg5通过Sirt1介导的Mfn2去乙酰化,抑制辐射诱导的Mfn2乙酰化和蛋白酶体降解,从而维持线粒体动力学和功能,并保护内皮屏障完整性。
主要证据
体内实验:小鼠肺组织H&E和免疫荧光显示Rg5减轻辐射引起的肺泡损伤和内皮连接破坏;体外实验:PPMECs中Rg5降低ROS、凋亡、线粒体膜电位丧失和线粒体碎片化,并恢复紧密连接蛋白ZO-1和VE-cadherin的表达;Sirt1敲低或抑制逆转了这些保护效应。
研究意义
作者提出人参皂苷Rg5或含Rg5的制剂可能作为减轻辐射诱导的内皮功能障碍和血管渗漏的新型治疗策略,从而降低急性肺损伤的严重程度并提高患者对放疗的耐受性。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

体内动物模型建立与药物预处理

评估人参皂苷Rg5对辐射诱导的肺微血管内皮损伤的保护作用

C57BL/6小鼠随机分为6组,经腹腔注射Rg5(30 mg/kg/天)3天或对照,然后接受10或20 Gy全身照射,1周后处死,取肺组织进行H&E和免疫荧光分析。

2

体外细胞模型建立与药物预处理

评估Rg5对辐射诱导的原代肺微血管内皮细胞损伤的保护作用

使用商业来源的PPMECs,用Rg5(20或60 μM)预处理6小时,然后接受0、5或10 Gy照射,72小时后分析凋亡、ROS、线粒体功能和屏障功能。

3

凋亡和氧化应激检测

验证Rg5对辐射诱导的细胞凋亡和ROS产生的抑制作用

通过流式细胞术检测Annexin V-PE/7-AAD染色评估凋亡,DCFH-DA染色评估ROS水平。

4

线粒体功能与形态检测

评估Rg5对辐射诱导的线粒体功能障碍和碎片化的保护作用

JC-1染色检测线粒体膜电位;CellLight Mitochondria-GFP标记线粒体,免疫荧光染色ZO-1,使用ImageJ分析线粒体长度。

5

机制验证:Sirt1-Mfn2通路

验证Rg5通过Sirt1介导的Mfn2去乙酰化抑制其降解

使用Sirt1 shRNA敲低或EX527抑制Sirt1,通过Western blot检测Mfn2表达;免疫共沉淀检测Mfn2乙酰化和泛素化;CHX追踪实验检测Mfn2蛋白稳定性。

6

Sirt1依赖性验证

确认Rg5的保护作用是否依赖于Sirt1

在Sirt1敲低或EX527抑制的PPMECs中,检测JC-1、ROS、凋亡、紧密连接蛋白表达和线粒体形态。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
X射线辐照仪 (型号X-RAD 320)Precision X-RayX-RAD 320
FuGENE 6转染试剂Promega--
Selisistat (EX527)Selleck--
人参皂苷Rg5HerbSubstance--
原代肺微血管内皮细胞(PPMECs)Procell--
PLKO.1-puro载体----
Claudin-5抗体ThermoFisher Scientific352588
CD31抗体Abcamab305210
ZO-1抗体ThermoFisher Scientific339194
VE-钙粘蛋白抗体Abcamab225443
二抗InvitrogenA-11001
二抗InvitrogenA-11012
DAPISigmaD9542
ProLong Gold防淬灭封片剂ThermoFisherP36930
荧光显微镜ZeissLSM 710
Transwell插入式培养皿(聚碳酸酯,0.4 μm)Corning3412
FITC-葡聚糖70kDSigmaFD70S
Annexin V-PE----
7-AAD----
DCFH-DASigmaD6883
流式细胞仪BDFACSAria III
RIPA裂解液Thermo Fisher89900
蛋白酶抑制剂Roche11836170001
磷酸酶抑制剂Roche4906845001
PVDF膜MilliporeIPVH00010
ECL检测试剂盒Thermo Fisher34580
ChemiDoc XRS+成像系统Bio-Rad--
抗Mfn2抗体Proteintech12186-1-AP
抗乙酰赖氨酸抗体Abcamab22550
抗泛素抗体Cell Signaling#3936
JC-1染料Molecular Probes--
CellLight线粒体GFPThermoFisher Scientific--
CoraLite594标记的ZO-1抗体ProteintechCL594-82870-7
GraphPad Prism 10.1.2GraphPad Software10.1.2

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
小鼠品系:C57BL/6,6周龄;分组:6组,每组n=6;Rg5剂量:30 mg/kg/天,连续3天,腹腔注射;照射剂量:10 Gy或20 Gy,剂量率1.2 Gy/min;处死时间:照射后1周
阅读提示:Materials and methods 部分动物研究、照射方案;图1A
细胞处理
PPMECs来源:Procell;培养条件:按推荐;Rg5浓度:20 μM和60 μM,处理6小时;照射剂量:5 Gy或10 Gy,剂量率约1 Gy/min;检测时间:照射后72小时
阅读提示:Materials and methods 部分培养、照射方案;图2
Sirt1敲低或抑制
shSirt1序列:5′-GCGGCTTGATGGTAATCAGTA-3′;MOI=10;EX527浓度:10 μM;处理时间:6小时
阅读提示:Materials and methods 慢病毒制备、图4
凋亡和ROS检测
Annexin V-PE/7-AAD染色;DCFH-DA染色;检测时间:照射后72小时
阅读提示:Materials and methods 凋亡和ROS检测;图2B-C
屏障功能
Transwell孔径0.4 μm;FITC-Dextran浓度1 mg/mL;孵育时间1小时;荧光检测激发485nm/发射535nm
阅读提示:Materials and methods FITC-Dextran扩散实验;图2K-L
线粒体功能
JC-1染料浓度2 μM,孵育30分钟;CellLight Mitochondria-GFP孵育16小时
阅读提示:Materials and methods JC-1染色、线粒体标记;图5A-B