体内动物模型建立与药物预处理
评估人参皂苷Rg5对辐射诱导的肺微血管内皮损伤的保护作用
C57BL/6小鼠随机分为6组,经腹腔注射Rg5(30 mg/kg/天)3天或对照,然后接受10或20 Gy全身照射,1周后处死,取肺组织进行H&E和免疫荧光分析。
Ginsenoside Rg5 alleviates radiation-induced acute lung vascular endothelium injury by reducing mitochondrial apoptosis via Sirt1.
包含体内小鼠模型(C57BL/6)和体外PPMECs模型,并进行了功能验证(凋亡、氧化应激、屏障功能)和机制验证(Mfn2乙酰化、Sirt1敲低/抑制)。
C57BL/6小鼠 人原代肺微血管内皮细胞(PPMECs) HEK293T细胞(用于慢病毒包装)
小鼠品系:C57BL/6,6周龄 人参皂苷Rg5给药剂量:30 mg/kg/天,腹腔注射,连续3天 照射剂量:小鼠10或20 Gy(1.2 Gy/min);细胞0、5或10 Gy(1 Gy/min) PPMECs来源:Procell(武汉),培养条件按推荐 Sirt1敲低慢病毒MOI=10 EX527浓度:10 μM
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估人参皂苷Rg5对辐射诱导的肺微血管内皮损伤的保护作用
C57BL/6小鼠随机分为6组,经腹腔注射Rg5(30 mg/kg/天)3天或对照,然后接受10或20 Gy全身照射,1周后处死,取肺组织进行H&E和免疫荧光分析。
评估Rg5对辐射诱导的原代肺微血管内皮细胞损伤的保护作用
使用商业来源的PPMECs,用Rg5(20或60 μM)预处理6小时,然后接受0、5或10 Gy照射,72小时后分析凋亡、ROS、线粒体功能和屏障功能。
验证Rg5对辐射诱导的细胞凋亡和ROS产生的抑制作用
通过流式细胞术检测Annexin V-PE/7-AAD染色评估凋亡,DCFH-DA染色评估ROS水平。
评估Rg5对辐射诱导的线粒体功能障碍和碎片化的保护作用
JC-1染色检测线粒体膜电位;CellLight Mitochondria-GFP标记线粒体,免疫荧光染色ZO-1,使用ImageJ分析线粒体长度。
验证Rg5通过Sirt1介导的Mfn2去乙酰化抑制其降解
使用Sirt1 shRNA敲低或EX527抑制Sirt1,通过Western blot检测Mfn2表达;免疫共沉淀检测Mfn2乙酰化和泛素化;CHX追踪实验检测Mfn2蛋白稳定性。
确认Rg5的保护作用是否依赖于Sirt1
在Sirt1敲低或EX527抑制的PPMECs中,检测JC-1、ROS、凋亡、紧密连接蛋白表达和线粒体形态。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | X射线辐照仪 (型号X-RAD 320) | Precision X-Ray | X-RAD 320 |
| 细胞培养 | FuGENE 6转染试剂 | Promega | -- |
| 药物处理 | Selisistat (EX527) | Selleck | -- |
| 人参皂苷Rg5 | HerbSubstance | -- | |
| 细胞培养 | 原代肺微血管内皮细胞(PPMECs) | Procell | -- |
| PLKO.1-puro载体 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Claudin-5抗体 | ThermoFisher Scientific | 352588 |
| CD31抗体 | Abcam | ab305210 | |
| ZO-1抗体 | ThermoFisher Scientific | 339194 | |
| VE-钙粘蛋白抗体 | Abcam | ab225443 | |
| 二抗 | Invitrogen | A-11001 | |
| 二抗 | Invitrogen | A-11012 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| ProLong Gold防淬灭封片剂 | ThermoFisher | P36930 | |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | Zeiss | LSM 710 |
| 屏障功能实验 | Transwell插入式培养皿(聚碳酸酯,0.4 μm) | Corning | 3412 |
| FITC-葡聚糖70kD | Sigma | FD70S | |
| 流式细胞术 | Annexin V-PE | -- | -- |
| 7-AAD | -- | -- | |
| ROS检测 | DCFH-DA | Sigma | D6883 |
| 流式细胞仪 | 流式细胞仪 | BD | FACSAria III |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher | 89900 |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11836170001 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | 4906845001 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| ECL检测试剂盒 | Thermo Fisher | 34580 | |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫共沉淀 | 抗Mfn2抗体 | Proteintech | 12186-1-AP |
| 抗乙酰赖氨酸抗体 | Abcam | ab22550 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling | #3936 | |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1染料 | Molecular Probes | -- |
| 线粒体标记 | CellLight线粒体GFP | ThermoFisher Scientific | -- |
| 免疫荧光 | CoraLite594标记的ZO-1抗体 | Proteintech | CL594-82870-7 |
| 统计分析 | GraphPad Prism 10.1.2 | GraphPad Software | 10.1.2 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系:C57BL/6,6周龄;分组:6组,每组n=6;Rg5剂量:30 mg/kg/天,连续3天,腹腔注射;照射剂量:10 Gy或20 Gy,剂量率1.2 Gy/min;处死时间:照射后1周 阅读提示:Materials and methods 部分动物研究、照射方案;图1A |
| 细胞处理 | PPMECs来源:Procell;培养条件:按推荐;Rg5浓度:20 μM和60 μM,处理6小时;照射剂量:5 Gy或10 Gy,剂量率约1 Gy/min;检测时间:照射后72小时 阅读提示:Materials and methods 部分培养、照射方案;图2 |
| Sirt1敲低或抑制 | shSirt1序列:5′-GCGGCTTGATGGTAATCAGTA-3′;MOI=10;EX527浓度:10 μM;处理时间:6小时 阅读提示:Materials and methods 慢病毒制备、图4 |
| 凋亡和ROS检测 | Annexin V-PE/7-AAD染色;DCFH-DA染色;检测时间:照射后72小时 阅读提示:Materials and methods 凋亡和ROS检测;图2B-C |
| 屏障功能 | Transwell孔径0.4 μm;FITC-Dextran浓度1 mg/mL;孵育时间1小时;荧光检测激发485nm/发射535nm 阅读提示:Materials and methods FITC-Dextran扩散实验;图2K-L |
| 线粒体功能 | JC-1染料浓度2 μM,孵育30分钟;CellLight Mitochondria-GFP孵育16小时 阅读提示:Materials and methods JC-1染色、线粒体标记;图5A-B |