miR-1247-3p regulation of CCND1 affects chemoresistance in colorectal cancer.
包含体外细胞模型（HCT8耐药株）的功能实验、靶基因验证（双荧光素酶）和表达检测，但缺乏动物模型和临床样本验证。
HCT8细胞系 HCT8/5-Fu耐药细胞系 HCT8/DDP耐药细胞系 293FT细胞系
细胞系来源：HCT8、HCT8/5-Fu、HCT8/DDP等（文中未明确具体来源） 耐药细胞诱导：5-Fu浓度从500 ng/ml逐步递增至5 μg/ml；DDP从100 ng/ml递增至1 μg/ml 转染条件：miR-1247-3p mimics/inhibitor（100 nM）使用Lipofectamine 2000，转染48小时 药物处理浓度：5-Fu 50 μg/ml，DDP 5 μg/ml处理48小时 MTT检测：细胞接种密度5x10^3细胞/孔
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估miR-1247-3p和CCND1在结直肠癌组织中的表达及其与预后的关联
利用GEO数据集（GSE190951、GSE128446）筛选差异miRNA；UALCAN分析miR-1247-3p和CCND1在CRC与正常组织中的表达；ENCORI和TCGA数据库分析miR-1247-3p对总生存期的影响；Kaplan-Meier Plotter分析CCND1对总生存期的影响；GEO2R分析耐药与敏感患者中miR-1247-3p表达差异。
验证HCT8/5-Fu和HCT8/DDP细胞系的耐药性，并检测miR-1247-3p的表达水平
通过MTT assay验证耐药性；转录组测序和RT-qPCR检测miR-1247-3p在HCT8、HCT8/5-Fu和HCT8/DDP细胞中的表达。
探究miR-1247-3p对耐药细胞增殖、凋亡、细胞周期和化疗敏感性的影响
在耐药细胞中转染miR-1247-3p mimics，在亲本细胞中转染inhibitor；通过RT-qPCR验证表达；MTT检测增殖和药物敏感性；流式细胞术检测凋亡和细胞周期；Western blot检测凋亡相关蛋白。
验证CCND1是miR-1247-3p的直接靶基因
利用生物信息学数据库预测靶基因；构建CCND1 3'UTR野生型和突变型质粒，通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-1247-3p与CCND1的直接结合；通过RT-qPCR和Western blot检测过表达或敲低miR-1247-3p后CCND1的表达变化。
验证CCND1对结直肠癌细胞化疗耐药性的影响
通过慢病毒感染构建shCCND1敲低细胞系；RT-qPCR和Western blot验证敲低效率；MTT assay检测敲低CCND1后细胞对化疗药物的敏感性。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine™ 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668030 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| pMD2.G质粒 | Addgene | 12259 | |
| psPAX2质粒 | Addgene | 12260 | |
| PEI MAX转染试剂 | Polysciences | 24765-1 | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Biosharp | BL628A |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Biosharp | BS111 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA-seq建库 | Ribo-Zero磁珠去除核糖体RNA试剂盒 | Epicentre | -- |
| AMPure XP磁珠 | 文未明确说明 | -- | |
| Phusion DNA聚合酶 | New England BioLabs | -- | |
| TBS-380荧光计 | Turner Designs | -- | |
| Truseq™小RNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| Novex TBE PAGE凝胶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒 | Vazyme Biotech | RC112-01 |
| 逆转录试剂盒 | Toyobo Life Science | FSQ-101 | |
| SYBR荧光染料 | 文未明确说明 | -- | |
| MTT assay | MTT | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Yeasen Biotechnology | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Yeasen Biotechnology | 20201ES86 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗体 | ABclonal Biotech | AS014 | |
| ECL化学发光底物检测试剂盒 | Bioprimacy | PMK0448 | |
| Cleaved-caspase3单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| CCND1单克隆抗体 | ABclonal Biotech | A19038 | |
| Active-caspase3单克隆抗体 | ABclonal Biotech | A19654 | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | 文未明确说明 | -- |
| 细胞培养 | HCT8细胞系 | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| HCT8/5-Fu耐药细胞系 | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| HCT8/DDP耐药细胞系 | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 293FT细胞 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0313 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与耐药株建立 | 细胞系来源（HCT8等）及耐药株的诱导浓度、递增方式、维持浓度 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 细胞转染 | 转染试剂（Lipofectamine 2000）、miRNA mimics/inhibitor浓度（100 nM）、转染时间（48小时） 阅读提示：Methods: Cell transfection |
| 药物处理与敏感性检测 | 5-Fu和DDP的处理浓度（50 μg/ml和5 μg/ml）及处理时间（48小时） 阅读提示：Methods: MTT assay, Flow cytometry |
| 凋亡与细胞周期检测 | Annexin V/PI染色、PI染色步骤及检测时间 阅读提示：Methods: Flow cytometry |
| Western blotting | 一抗稀释比例、二抗稀释比例（1:5000）、蛋白上样量（20 μg） 阅读提示：Methods: Western blotting |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 293FT细胞密度、质粒组合、检测时间（转染后24小时） 阅读提示：Methods: Dual luciferase reporter gene assay |
