体外细胞增殖与存活检测
评估AJ单独及联合RT对NSCLC细胞存活和增殖的影响。
使用CCK-8检测不同浓度AJ（0-400μg/mL）处理24h和48h后的细胞存活率，并检测AJ（25μg/mL）和RT（8Gy）处理24h后的细胞存活率；使用克隆形成实验检测处理后的细胞增殖能力。
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白蔹增强非小细胞肺癌放疗效果
Ampelopsis japonica enhances the effect of radiotherapy in non-small cell lung cancer.
实验完整度
高包含体外细胞实验（CCK-8增殖、克隆形成、流式凋亡、Western blot）和体内移植瘤模型，并融合生物信息学分析，多层级验证功能与机制。
主要模型
HCC827细胞 H1299细胞 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
AJ浓度25μg/mL处理24h RT剂量8Gy处理24h 细胞分组：对照、AJ、RT、RT+AJ 体内AJ给药剂量：低5mg/kg，中10mg/kg，高20mg/kg，口服灌胃，每日一次，共15天 体内RT方案：第10、12、14天给予8Gy，总剂量24Gy
摘要
背景：放疗广泛用于非小细胞肺癌（NSCLC）的临床治疗，但其效果往往不尽人意。白蔹（AJ）是一种具有抗炎和抗癌活性的传统中草药。然而，AJ是否能增强NSCLC的放疗效果仍需进一步探讨。方法：在体内，采用BALB/c裸鼠建立异种移植瘤模型，探讨AJ是否能增强NSCLC的放射治疗（RT）效果。在体外，使用人NSCLC细胞系HCC827和H1299探讨AJ对RT处理的NSCLC细胞增殖和凋亡的影响。此外，进行生物信息学分析以分析AJ调控的信号通路。结果：白蔹在体内增强了RT对NSCLC肿瘤生长的抑制作用。同时，AJ进一步增强了RT对NSCLC增殖的抑制作用和RT对NSCLC凋亡的促进作用。生物信息学分析显示AJ调控PI3K-Akt信号通路。我们证实AJ降低了PI3K-Akt信号通路的蛋白水平。此外，AJ与RT联合抑制了PI3K-Akt信号通路的激活。结论：白蔹通过抑制PI3K-Akt信号通路，增强了RT对NSCLC细胞增殖和肿瘤生长的抑制作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 白蔹（AJ）能否增强非小细胞肺癌（NSCLC）的放疗效果，并探究其潜在机制。
- 核心机制
- AJ通过抑制PI3K-Akt信号通路的激活，增强放疗诱导的NSCLC细胞凋亡。
- 主要证据
- 体内HCC827异种移植瘤模型显示AJ增强RT对肿瘤生长的抑制；体外CCK-8、克隆形成和流式细胞术显示AJ增强RT对NSCLC增殖的抑制和凋亡的促进；Western blot显示AJ联合RT显著降低p-PI3K、p-Akt、p-NOS3蛋白水平。
- 研究意义
- AJ可能作为增强放疗疗效的潜在候选药物，为NSCLC治疗提供辅助治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞凋亡检测
评估AJ单独及联合RT对NSCLC细胞凋亡的影响。
使用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测处理后的细胞凋亡率，并通过Western blot检测凋亡相关蛋白c-caspase-3、Bax和Bcl-2的表达。
生物信息学分析
识别AJ活性成分，预测调控靶点及信号通路。
利用TCMSP数据库筛选AJ活性成分（OB≥30%，DL≥0.18），DrugBank和GeneCards数据库获取靶点，Venn图获取交集基因（71个），并进行GO和KEGG富集分析。
机制验证（PI3K-Akt通路）
验证AJ对PI3K-Akt信号通路蛋白表达的影响。
通过Western blot检测NSCLC细胞中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-NOS3、NOS3蛋白水平，并比较各组表达差异。
体内异种移植瘤模型
在体内评估AJ联合RT对NSCLC肿瘤生长的影响。
使用BALB/c裸鼠皮下注射HCC827细胞建立移植瘤模型，第10天起给予RT和不同剂量AJ处理，定期测量肿瘤体积，第25天取材称重。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证药物毒性及细胞增殖
验证机制通路
分析药物活性成分及靶点
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 制备AJ提取物 | 白蔹干粉 | Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. | -- |
| 二甲基亚砜 | Beyotime | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Procell | -- | |
| CCK-8检测 | 细胞计数试剂盒-8试剂 | Beyotime | C0037 |
| 酶标仪 | BioTek | -- | |
| 克隆形成实验 | 胰蛋白酶（0.25%） | -- | -- |
| 磷酸盐缓冲液 | Beyotime | -- | |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Beyotime | C1062S |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 流式细胞仪 | Becton, Dickinson and Company | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0011 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 山羊抗兔IgG H&L（HRP） | Abcam | ab6721 | |
| ECL化学发光试剂盒 | Yeasen | 36208ES60 | |
| 抗c-caspase-3抗体 | HuaBio | ET1602-39 | |
| 抗Bax抗体 | HuaBio | ET1603-34 | |
| 抗Bcl-2抗体 | HuaBio | ET1603-11 | |
| 抗p-PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | #13857 | |
| 抗PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | #4249 | |
| 抗p-AKT抗体 | Cell Signaling Technology | #9272 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | #9271 | |
| 抗p-NOS抗体 | Cell Signaling Technology | #2977 | |
| 抗NOS抗体 | Cell Signaling Technology | #9575 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| 动物实验 | RS 2000pro生物X射线辐照仪 | Rad Source | -- |
| 水合氯醛（4%） | -- | -- | |
| 游标卡尺 | -- | -- | |
| 生物信息学分析 | Image J软件 | National Institutes of Health | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系（HCC827、H1299）来源、培养基（RPMI-1640含10%FBS和1%青霉素-链霉素）、CO2浓度（5%）、温度（37°C）、AJ浓度（25μg/mL）、RT剂量（8Gy）、处理时间（24h） 阅读提示：见Materials and methods中的Cell culture and treatment |
| CCK-8检测 | 细胞接种密度（5×10^3细胞/孔）、CCK-8处理时间（1h）、检测波长（450nm） 阅读提示：见Materials and methods中的Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay |
| 克隆形成实验 | 细胞接种密度（1000细胞/孔）、培养时间（14天）、结晶紫染色时间（15min）、4%多聚甲醛固定时间（30min） 阅读提示：见Materials and methods中的Colon formation assay |
| 凋亡检测 | 细胞数量（5×10^4）、离心条件（1000g, 5min）、Annexin V-FITC和PI孵育时间（15min, 25°C）、流式细胞仪型号（BD） 阅读提示：见Materials and methods中的Apoptosis detection |
| Western blot | 一抗稀释比例如c-caspase-3（1:5000）、Bax（1:20000）、Bcl-2（1:5000）、p-PI3K（1:1000）等；二抗（Goat Anti-Rabbit IgG H&L [HRP]）稀释比（1:2000）；孵育时间：一抗4°C过夜，二抗室温2h 阅读提示：见Materials and methods中的Western blot assay |
| 异种移植瘤模型 | 小鼠品系（BALB/c裸鼠）及体重（20±2g）、细胞植入数（1×10^6 HCC827细胞）、RT方案（第10、12、14天，每次8Gy，总剂量24Gy）、AJ给药剂量（低5mg/kg、中10mg/kg、高20mg/kg）、给药方式（口服灌胃，每日一次，共15天）、肿瘤取材时间（第25天） 阅读提示：见Materials and methods中的Xenograft tumor model |
| 生物信息学分析 | 数据库（TCMSP、DrugBank、GeneCards）、筛选条件（OB≥30%，DL≥0.18） 阅读提示：见Materials and methods中的Bioinformatic analysis |
| 统计分析 | 统计方法（正态分布组间用one-way ANOVA + Tukey检验，非正态用Kruskal-Wallis + Dunn检验）、显著性水平（P<0.05）、独立实验次数（3次，每次三重复） 阅读提示：见Materials and methods中的Statistical analysis |