组织水平蛋白组学和代谢组学分析
筛选PNF中差异表达蛋白和代谢物，鉴定关键分子。
对PNF患者和健康人的皮肤组织进行蛋白组学分析，对血清样本进行非靶向代谢组学分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
SUCLG1促进丛状神经纤维瘤中的有氧呼吸和进展
SUCLG1 promotes aerobic respiration and progression in plexiform neurofibroma.
实验完整度
中包含组织蛋白组学、代谢组学及细胞功能实验（CCK-8、划痕、流式）、代谢检测和机制验证（WB、电子显微镜），但缺少体内动物实验验证。
主要模型
PNF细胞系ipNF95.6和ipNF05.5 人施万细胞系HSC 患者肿瘤组织和正常皮肤组织
重点核对
SUCLG1在PNF组织和细胞中的表达水平（组织免疫荧光、细胞WB） SUCLG1敲低和过表达的效率及功能表型（增殖、迁移、凋亡、细胞周期） 线粒体功能检测（Seahorse OCR/ECAR）和线粒体质量评估（mtDNA/gDNA、TEM、融合蛋白WB） SLC25A1表达变化及抑制剂CTPI-2处理对细胞功能的影响
摘要
丛状神经纤维瘤（PNF）是影响20-50%的I型神经纤维瘤病（NF1）患者的良性肿瘤。PNF具有恶变风险。目前尚无有效的治愈方法。其发病可能与遗传和代谢异常有关，但确切机制仍不清楚。三羧酸循环中的催化酶琥珀酰辅酶A连接酶GDP/ADP形成亚基α（SUCLG1）在PNF中高表达。本研究旨在探讨SUCLG1在PNF细胞功能和代谢中的作用。通过western blotting和免疫荧光验证SUCLG1的表达。诱导SUCLG1敲低和过表达后，评估PNF细胞的功能变化，以及SUCLG1对细胞呼吸和葡萄糖代谢的影响。定量PCR、WB、电子显微镜和流式细胞术表明，SUCLG1增强了线粒体质量并促进线粒体融合，从而驱动肿瘤细胞增殖和迁移，抑制凋亡并改变细胞周期。Seahorse实验表明，SUCLG1表达升高增强了细胞有氧呼吸而不影响糖酵解过程。这表明PNF中SUCLG1上调不会触发与恶性肿瘤相关的瓦伯格效应。本研究还证明了当SUCLG1表达升高时，通过促进SLC25A1基因的表达水平对细胞功能产生正调控。总之，SUCLG1改变了线粒体质量控制机制以增强细胞有氧呼吸，从而驱动PNF的发病机制。因此，SUCLG1可作为未来治疗策略的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨SUCLG1在PNF细胞功能和代谢中的作用及其作为治疗靶点的潜力。
- 核心机制
- SUCLG1通过促进线粒体融合和质量控制，增强线粒体有氧呼吸，并上调SLC25A1表达，从而驱动PNF细胞增殖、迁移并抑制凋亡。
- 主要证据
- 在PNF细胞中敲低或过表达SUCLG1后，CCK-8、划痕和流式显示细胞功能变化；Seahorse显示有氧呼吸增强而糖酵解不变；WB和TEM显示线粒体融合蛋白（MFN1/2、OPA1）升高和线粒体形态延长；SLC25A1蛋白水平变化及抑制剂部分逆转了功能。
- 研究意义
- SUCLG1是PNF的潜在治疗靶点，并为研究代谢机制提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证SUCLG1和柠檬酸在PNF中的表达
在组织和细胞水平验证SUCLG1及柠檬酸的高表达。
使用免疫荧光检测组织SUCLG1表达，WB检测细胞SUCLG1蛋白，试剂盒检测柠檬酸含量。
SUCLG1功能获得和丧失实验
评估SUCLG1对PNF细胞增殖、迁移、凋亡和细胞周期的影响。
在ipNF05.5中敲低SUCLG1，在ipNF95.6中过表达，然后进行CCK-8、划痕实验和流式细胞术。
代谢功能检测
评估SUCLG1对细胞有氧呼吸和糖酵解的影响。
使用Seahorse XF细胞线粒体压力测试和糖酵解压力测试，检测OCR和ECAR。
线粒体质量评估
探究SUCLG1对线粒体DNA含量、形态、融合蛋白和ROS的影响。
RT-qPCR检测mtDNA/gDNA比率，TEM观察线粒体形态，WB检测融合蛋白（MFN1/2、OPA1），ELISA检测ROS水平。
SLC25A1机制验证
验证SUCLG1通过SLC25A1影响细胞功能。
WB检测SLC25A1、CS、ACLY表达，ELISA检测酶活性，并在过表达SUCLG1的细胞中加入SLC25A1抑制剂CTPI-2后检测功能变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 胎牛血清 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 蛋白质组学分析 | 高效液相色谱仪 | Shimadzu | -- |
| 代谢组学分析 | 质谱仪 | Thermo Fisher, Germany | -- |
| 超高效液相色谱仪 | Thermo Fisher, Germany | -- | |
| Hypesil Gold C18色谱柱 | Thermo Fisher, USA | -- | |
| RT-qPCR | RNAiso Plus试剂 | Takara Bio, Inc. | -- |
| HiScript RT SuperMix逆转录试剂盒 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | -- | |
| DNA提取试剂盒 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | -- | |
| SYBR Green预混液 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | -- | |
| 实时荧光定量PCR仪 | Roche Diagnostics | -- | |
| Western blot | 总蛋白提取试剂盒 | Invent Biotechnologies, Inc. | -- |
| RIPA裂解液 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- | |
| 快速封闭液 | Beyotime Institute of Biotechnology | P0252 | |
| β-actin抗体 | Proteintech Group, Inc. | 66009-1-I | |
| α-tubulin抗体 | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | GB15201 | |
| SUCLG1兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 8071 | |
| 柠檬酸合酶兔多克隆抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | A5713 | |
| SLC25A1兔多克隆抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | A24754 | |
| MFN1兔多克隆抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | A9880 | |
| MFN2兔单克隆抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | A19678 | |
| OPA1兔多克隆抗体 | ABclonal Biotech Co., Ltd. | A9833 | |
| ACLY兔多克隆抗体 | Proteintech Group, Inc. | 15421-1-AP | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Proteintech Group, Inc. | SA00001-2 | |
| 抗鼠二抗 | Proteintech Group, Inc. | SA00001-1 | |
| 增强化学发光液 | Sparkjade | ED0016-B | |
| 化学发光成像系统 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | -- | |
| 免疫荧光染色 | 环保脱蜡液 | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1128 |
| 柠檬酸抗原修复液 | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1202 | |
| DAPI染色液 | -- | -- | |
| CY3标记的山羊抗兔二抗 | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | GB21303 | |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠二抗 | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | GB25301 | |
| 荧光显微镜 | Nikon Corporation | ECLIPSE | |
| 病毒包装与感染 | 慢病毒载体 | GenePharma Co., Ltd. | -- |
| 转染试剂 | GenePharma Co., Ltd. | GO4001 | |
| 抑制剂处理 | CTPI-2 | MedChemExpress | HY-123986 |
| CCK-8实验 | 细胞增殖毒性检测试剂盒 | Wuhan Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 酶标仪 | Thermo Fisher, USA | 1410101 | |
| 流式细胞术 | 凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | 559763 |
| 细胞周期检测试剂盒 | Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd. | KGA512 | |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter, Inc. | -- | |
| 透射电子显微镜 | 环氧树脂812 | MerckMillipore | 45345 |
| 超薄切片机 | Leica GmbH | UC7rt | |
| 透射电子显微镜 | JEOL Ltd. | JEM-1400FLASH | |
| ROS测量 | ROS ELISA试剂盒 | Jiangsu ELISA Industry Co., Ltd. | MM-1893H2 |
| 代谢物含量测定 | 提取液 | Keyybio | ADS-W-S002 |
| 柠檬酸含量试剂盒 | Keyybio | ADS-W-S002 | |
| 酶活性测定 | CS ELISA试剂盒 | Keyybio | MM-63621H2 |
| ACLY ELISA试剂盒 | Keyybio | KYY-62138H1 | |
| 代谢能量测定 | Seahorse XF DMEM培养基 | Agilent Technologies, Inc. | 103575-100 |
| 葡萄糖 | Agilent Technologies, Inc. | 103577-100 | |
| 谷氨酰胺 | Agilent Technologies, Inc. | 103579-100 | |
| 海马XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent Technologies, Inc. | 103015-100 | |
| 海马XF糖酵解压力测试试剂盒 | Agilent Technologies, Inc. | 103020-100 | |
| 安捷伦Seahorse XFe96分析仪 | Agilent Technologies, Inc. | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9.4.1 | Dotmatics, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分、培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Materials and methods 部分 'Tissue collection and cell culture' |
| SUCLG1敲低和过表达 | 慢病毒载体序列、MOI=100、感染时间24h 阅读提示：Materials and methods 部分 'Knockdown and overexpression (OE) of SUCLG1' |
| 代谢功能检测 | 细胞密度5x10^4/ml，检测试剂盒型号，使用XF DMEM培养基 阅读提示：Materials and methods 部分 'Metabolic energy assay' |
| SLC25A1抑制剂处理 | CTPI-2浓度（50 μM）和处理时间（24h） 阅读提示：Materials and methods 部分 'Inhibitor-treated cells' |
| 线粒体质量评估 | mtDNA/gDNA检测方法，TEM样品制备条件，ROS检测试剂盒 阅读提示：Materials and methods 部分 'Transmission electron microscopy'和'ROS measurement' |