验证RNPEP在HCC肿瘤和细胞系中的高表达
确认RNPEP在HCC中的表达水平及其与转移的关系
使用TIMER2.0数据库和TNM plot数据库分析RNPEP表达；用实时PCR检测HCC细胞系中RNPEP mRNA水平；用ELISA检测细胞上清中RNPEP浓度。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
肿瘤外泌体RNPEP通过诱导癌症相关成纤维细胞活化促进肝癌肺转移
Tumor exosomal RNPEP promotes lung metastasis of liver cancer via inducing cancer-associated fibroblast activation.
实验完整度
高包括体外细胞实验、外泌体功能验证、体内异种移植和肺转移模型、mRNA-seq及机制验证等多层级验证。
主要模型
MHCC-97L细胞 HCC-LM3和MHCC-97H细胞 MRC-5成纤维细胞 裸鼠皮下移植和原位肝移植模型
重点核对
高转移性HCC细胞系（HCC-LM3, MHCC-97H）的外泌体中RNPEP高表达 外泌体处理MRC-5细胞（20μg/mL，24小时）诱导CAF活化 RNPEP敲低后外泌体对MRC-5细胞CAF标志物表达和迁移的影响 体内实验中MRC-5细胞与MHCC-97L细胞按1:4比例混合皮下注射 NF-κB信号通路在MRC-5细胞中的激活情况
摘要
癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境（TME）中的重要角色，因其促进肿瘤进展和转移的作用而备受关注。值得注意的是，高转移性肝细胞癌（HCC）细胞来源的外泌体已被证明能够将正常成纤维细胞转化为CAFs，进而促进低转移性HCC细胞的肺转移。然而，肿瘤外泌体诱导的转移前微环境形成的机制尚不清楚。在本研究中，分泌型精氨酰氨基肽酶（RNPEP）在HCC患者血浆中高表达。此外，高转移性HCC细胞的外泌体中RNPEP表达水平升高。这些外泌体诱导人成纤维细胞系MRC-5出现明显的CAF样特性，表现为CAF标志物表达增加和迁移能力增强。更引人注目的是，高转移性肿瘤外泌体教育的MRC-5细胞的分泌物增加了低转移性HCC细胞系MHCC-97L的肿瘤干性并促进上皮间质转化（EMT）。然而，在高转移性HCC细胞的外泌体中敲低RNPEP则削弱了上述变化。体内动物研究强调了外泌体RNPEP通过诱导CAF活化对MHCC-97L细胞的促肿瘤和促转移作用。此外，肿瘤来源的外泌体RNPEP诱导MRC-5细胞中NF-κB信号通路的活化，这是与CAF活化相关的关键通路。总之，这些结果为肿瘤来源的外泌体RNPEP在HCC肺转移过程中与CAFs的串扰提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 高转移性HCC细胞来源的外泌体RNPEP是否通过诱导CAF活化促进低转移性HCC细胞的肺转移？
- 核心机制
- 肿瘤来源的外泌体RNPEP通过激活NF-κB信号通路诱导成纤维细胞活化为CAF，进而促进低转移性HCC细胞的肿瘤干性、EMT和肺转移。
- 主要证据
- 体外实验中，高转移性HCC细胞外泌体诱导MRC-5细胞CAF标志物（α-SMA、vimentin）表达增加和迁移增强；敲低RNPEP后这些效应减弱。体内异种移植和肺转移模型显示，外泌体RNPEP促进MHCC-97L细胞肿瘤生长和肺转移。
- 研究意义
- 肿瘤来源的外泌体RNPEP可能是肝癌治疗策略进一步开发的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证RNPEP在HCC细胞外泌体中的高表达
检测外泌体中RNPEP水平，并确认其来源
从HCC细胞和血浆中分离外泌体，通过TEM和外泌体标志物（CD63、TSG101）鉴定，Western blot检测RNPEP水平。
验证高转移性HCC外泌体RNPEP对成纤维细胞活化的促进作用
评估外泌体RNPEP是否诱导MRC-5成纤维细胞向CAF样细胞转化
用慢病毒敲低RNPEP，分离外泌体处理MRC-5细胞，通过Western blot检测α-SMA和vimentin表达，实时PCR检测TGFB2, COL4A1, COL12A1基因表达，Transwell实验检测迁移。
验证外泌体RNPEP诱导的CAF活化对低转移性HCC细胞干性和EMT的影响
测试活化成纤维细胞的条件培养基是否促进MHCC-97L细胞的干性和EMT
收集处理后的MRC-5条件培养基（CM），处理MHCC-97L细胞，进行球体形成实验、实时PCR检测干性基因（OCT4, NANOG, LGR5）和EMT基因（E-cadherin, snail, vimentin），Transwell检测迁移。
体内验证外泌体RNPEP对肿瘤生长和肺转移的影响
在动物模型中证实外泌体RNPEP通过CAF活化促进MHCC-97L细胞肿瘤生长和转移
将外泌体教育的MRC-5细胞与MHCC-97L-mCherry细胞混合后皮下注射裸鼠，监测肿瘤生长；将肿瘤组织原位移植到肝脏，观察肺转移。
转录组分析揭示外泌体RNPEP作用机制
通过mRNA测序分析外泌体RNPEP对成纤维细胞基因表达谱的影响
对外泌体教育的MRC-5细胞进行mRNA-seq，分析差异表达基因并进行KEGG通路富集，验证NF-κB信号通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| MEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 外泌体分离 | 超速离心机 | Hitachi, Ltd. | -- |
| 外泌体鉴定 | 醋酸双氧铀 | -- | -- |
| 外泌体示踪 | DiI荧光染料 | -- | -- |
| DiO荧光染料 | -- | -- | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Proteintech | PR20001 |
| 核蛋白提取试剂盒 | Proteintech | PK10014 | |
| Western blot | PVDF膜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 脱脂牛奶 | -- | -- | |
| ECL检测试剂盒 | Proteintech | PK10003 | |
| RNPEP抗体 | Proteintech | 14764-1-AP | |
| CD63抗体 | Proteintech | 25682-1-AP | |
| TSG101抗体 | Proteintech | 28283-1-AP | |
| IκBα抗体 | Abclonal | A19714 | |
| p-IκBα抗体 | Abclonal | AP0707 | |
| NF-κB p65抗体 | Abclonal | A2547 | |
| p-NF-κB p65抗体 | Abclonal | AP0124 | |
| Histone H3抗体 | Proteintech | 17168-1-AP | |
| β-Actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 山羊抗兔IgG (H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| RNA提取 | TRIpure试剂 | BioTeke Corporation Co., Ltd. | -- |
| RT-qPCR | All-in-One第一链合成预混液 | Magen Biotech | MD80101 |
| SYBR Green Mix | Solarbio Life Science | SY1020 | |
| 实时荧光定量PCR系统 | Bioneer | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | LABSELECT | 14341 |
| 结晶紫 | Amresco | 0528 | |
| 荧光显微镜 | 显微镜 | OLYMPUS | -- |
| 免疫荧光 | Ki67抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA1-38032 |
| 山羊抗兔IgG H&L (Cy3®) | Abcam | ab6939 | |
| DAPI染料 | Aladdin reagent | D106471-5mg | |
| H&E染色 | 伊红 | Sangon Biotech | A600190 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞和外泌体处理 | 外泌体处理MRC-5细胞的浓度和时间：20 μg/mL，24小时 阅读提示：见Materials and Methods 2.6 Exosome tracing experiments 及 3.3节 |
| RNPEP敲低 | 慢病毒MOI：HCC-LM3 20，MHCC-97H 30；polybrene 6 μg/mL；嘌呤霉素筛选浓度：HCC-LM3 2 μg/mL，MHCC-97H 2.5 μg/mL 阅读提示：见Materials and Methods 2.3 Lentivirus generation and infection |
| 体外功能实验 | Transwell实验中迁移细胞染色后用结晶紫染色，处理时间24小时；球体形成实验培养14天 阅读提示：见Materials and Methods 2.9 Transwell assay 和 2.10 Spheroid formation assay |
| 动物实验 | 皮下移植：MRC-5和MHCC-97L细胞比例1:4，每只裸鼠注射细胞总量（2.5×10^5 MRC-5和1×10^6 MHCC-97L）；原位移植：1-mm3肿瘤块移植到肝脏；观察时间6周 阅读提示：见Materials and Methods 2.11 Animal studies |
| mRNA-seq分析 | 差异表达基因筛选标准：|log2Fold change|>1, p<0.05 阅读提示：见Materials and Methods 2.14 mRNA-seq analysis |