评估KRAS G12C抑制剂耐药细胞的交叉耐药性
确定耐KRAS G12C抑制剂的细胞是否对其他靶向RAS通路的抑制剂也耐药。
使用AMG510与buparlisib、linsitinib、gefitinib、trametinib或SHP099组合处理敏感和耐药细胞系，通过细胞活力测定和克隆形成实验评估效果，并利用GDSC数据库进行IC50相关性分析。
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YAP/TAZ通过抑制促凋亡和激活SLC7A5/mTOR轴介导对KRAS抑制剂的耐药性
YAP/TAZ mediates resistance to KRAS inhibitors through inhibiting proapoptosis and activating the SLC7A5/mTOR axis.
实验完整度
高包含体外细胞实验、异种移植瘤模型、转录组学和生物信息学分析等多个证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
KRAS G12C突变肺癌细胞系SW1573、H2030 KRAS G12C突变肺癌细胞系H358及获得性耐药株H358R KRAS G12D突变胰腺癌细胞系PANC1、HPAFII 小鼠异种移植瘤模型
重点核对
细胞系来源和培养条件：H358、SW1573等细胞系来自ATCC或ECACC，培养基RPMI 1640或DMEM，补充10%FBS 耐药细胞系构建：H358R通过AMG510浓度递增（0.1μM至1μM）诱导约6个月，H358R N20通过体内模型 敲低效率验证：YAP/TAZ和TEADs的敲低效果通过免疫印迹验证 药物处理浓度和时间：AMG510、ARS1620、MRTX849等处理浓度和时间在具体实验中明确，例如AMG510 1μM处理3天 动物实验：雌性小鼠，每组n=5，给药方案AMG510 30mg/kg每日口服
摘要
KRAS突变在多种人类癌症中频繁发生。靶向KRAS突变的选择性抑制剂的开发开启了靶向治疗的新时代。然而，对这些抑制剂的内在性和获得性耐药仍然是主要挑战。在此，我们发现对KRAS G12C抑制剂耐药的癌细胞也对其他靶向治疗（如RTK或SHP2抑制剂）表现出交叉耐药。转录组分析显示，Hippo-YAP/TAZ通路在内在耐药和获得性耐药细胞中被激活。YAP/TAZ的组成性激活赋予了对KRAS G12C抑制剂的耐药性，而敲低YAP/TAZ或TEADs使耐药细胞对这些抑制剂敏感。这种情况在KRAS G12D突变癌细胞中也观察到。机制上，YAP/TAZ通过下调促凋亡基因（如BMF、BCL2L11和PUMA）的表达来保护细胞免受KRAS抑制剂诱导的凋亡，并通过激活SLC7A5/mTORC1轴逆转KRAS抑制剂诱导的增殖阻滞。我们进一步证明，达沙替尼和MYF-03-176通过降低SRC激酶活性和TEAD活性显著增强KRAS抑制剂的疗效。总体而言，靶向Hippo-YAP/TAZ通路具有克服KRAS抑制剂耐药性的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KRAS抑制剂的内在和获得性耐药机制是什么，以及如何克服这种耐药性？
- 核心机制
- YAP/TAZ通过下调促凋亡基因（如BMF、BCL2L11、PUMA）保护细胞免受KRAS抑制剂诱导的凋亡，并通过激活SLC7A5/mTORC1轴逆转KRAS抑制剂诱导的增殖阻滞，从而介导耐药性。
- 主要证据
- 通过在多种细胞系中敲低YAP/TAZ或TEADs可增强KRAS抑制剂敏感性，异位表达YAP S127A或TAZ S89A赋予耐药性，及体内异种移植瘤实验显示达沙替尼联合AMG510显著抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 靶向Hippo-YAP/TAZ通路（如使用达沙替尼）有潜力克服KRAS抑制剂耐药性，改善KRAS突变癌症患者的预后。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析Hippo-YAP/TAZ通路在耐药细胞中的激活
探究YAP/TAZ通路是否在耐药细胞中被激活。
利用公共转录组数据（20个KRAS G12C突变细胞系）进行基因模块和转录因子分析，通过免疫荧光检测YAP/TAZ亚细胞定位，使用免疫印迹分析YAP/TAZ磷酸化状态。
验证YAP/TAZ激活对KRAS抑制剂耐药性的影响
确定YAP/TAZ激活是否足以赋予耐药性以及其是否对维持耐药性必要。
在敏感细胞中异位表达组成性激活的YAP S127A或TAZ S89A，检测对KRAS G12C抑制剂的敏感性；在耐药细胞中敲低YAP/TAZ或TEADs，检测敏感性变化和克隆形成能力。
阐明YAP/TAZ调控凋亡和增殖的机制
揭示YAP/TAZ调节细胞对KRAS抑制剂反应的分子机制。
通过RT-qPCR和免疫印迹检测凋亡相关基因（BMF, BCL2L11, PUMA等）和mTOR相关基因（SLC7A5等）的表达，结合功能实验（如敲低YAP/TAZ后添加Q-VD-OPh或siRNA）。
评估靶向YAP/TAZ的药物与KRAS抑制剂的协同效应
筛选能增强KRAS抑制剂疗效的YAP/TAZ通路调节剂。
使用棋盘法和克隆形成实验评估化合物（包括dasatinib和MYF-03-176）与KRAS抑制剂的协同作用。
在体内验证联合治疗的疗效
评估dasatinib联合AMG510在异种移植瘤模型中的抗肿瘤效果。
使用SW1573和H358R细胞建立裸鼠异种移植瘤模型，给予AMG510、dasatinib或联合治疗，监测肿瘤体积和体重，并通过免疫组化检测Ki67和cleaved caspase-3。
验证Hippo-YAP/TAZ通路在KRAS G12D抑制剂耐药中的作用
确认YAP/TAZ激活和耐药机制是否也适用于KRAS G12D突变。
检测KRAS G12D突变细胞系（HPAFII, PANC1, SW1990）中YAP/TAZ亚细胞定位，敲低YAP/TAZ后评估对MRTX1133的敏感性，以及联合dasatinib或MYF-03-176的效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | AMG510 | DC Chemicals | -- |
| MRTX1133 | DC Chemicals | -- | |
| 达沙替尼 | DC Chemicals | -- | |
| MYF-01-37 | DC Chemicals | -- | |
| MYF-03-176 | DC Chemicals | -- | |
| K975 | DC Chemicals | -- | |
| 辛伐他汀 | Selleckchem | -- | |
| 瑞舒伐他汀 | Selleckchem | -- | |
| 匹伐他汀 | Selleckchem | -- | |
| 氟伐他汀 | Selleckchem | -- | |
| 洛伐他汀 | Selleckchem | -- | |
| XAV-939 | Selleckchem | -- | |
| Ki16425 | Selleckchem | -- | |
| 毛喉素 | Selleckchem | -- | |
| ARS1620 | Selleckchem | -- | |
| 吉非替尼 | Selleckchem | -- | |
| 林西替尼 | Selleckchem | -- | |
| 曲美替尼 | Selleckchem | -- | |
| SHP099 | Selleckchem | -- | |
| PEG300 | Selleckchem | -- | |
| 吐温80 | Selleckchem | -- | |
| 维替泊芬 | MedChemExpress | -- | |
| MRTX849 | MedChemExpress | -- | |
| 布帕利西布 | MedChemExpress | -- | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- | |
| L-亮氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Procell | -- |
| DMEM培养基 | Procell | -- | |
| MEM培养基 | Procell | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 病毒包装和感染 | 聚凝胺 | Solarbio | -- |
| 筛选 | 嘌呤霉素 | TargetMol | -- |
| 潮霉素B | TargetMol | -- | |
| 肿瘤解离 | 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| 细胞活力测定 | CCK-8试剂盒 | Bimake | -- |
| BioTek Synergy HT酶标仪 | BioTek | -- | |
| 免疫印迹 | 硝酸纤维素膜 | Millipore | -- |
| ChemiScope 5300化学发光成像系统 | CLINX | -- | |
| 超敏ECL化学发光底物 | Biosharp | -- | |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒 | Foregene | -- |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara | -- | |
| RealStar Green Fast Mixture | Genstar | -- | |
| Bio-Rad CFX384实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| 抗体 | YAP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-101199 |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47724 | |
| BCL2L11抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-374358 | |
| PUMA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-374223 | |
| SLC7A5抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-374232 | |
| ERK1/2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-514302 | |
| p-YAP (Ser127)抗体 | Cell Signaling Technology | 4911 | |
| pan-TEAD抗体 | Cell Signaling Technology | 13295 | |
| SLC7A5抗体 | Cell Signaling Technology | 5347 | |
| LATS1抗体 | Cell Signaling Technology | 3477 | |
| p-MEK1/2 (Ser217/221)抗体 | Cell Signaling Technology | 9154 | |
| MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9122 | |
| p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| p-RSK (Thr359)抗体 | Cell Signaling Technology | 8753 | |
| RSK抗体 | Cell Signaling Technology | 9355 | |
| p-S6 (Ser235/236)抗体 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| p-AKT (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| TAZ抗体 | Sigma-Aldrich | HPA007415 | |
| β-actin抗体 | Shanghai HuiOu Biotech Co., Ltd. | HOA013BA01 | |
| HA抗体 | Shanghai HuiOu Biotech Co., Ltd. | HOA012HA01 | |
| lamin A/C抗体 | PTM BIO | PTM-5746 | |
| 免疫印迹 | HRP标记的山羊抗小鼠二抗 | Shanghai HuiOu Biotech Co., Ltd. | HOA024GM01 |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Shanghai HuiOu Biotech Co., Ltd. | HOA024GR01 | |
| 载体构建 | pLVX-puro载体 | Bio-research innovation center Suzhou | -- |
| pLVX-puro-YAP2 S127A质粒 | Bio-research innovation center Suzhou | -- | |
| pCDN3-TAZ S89A质粒 | Bio-research innovation center Suzhou | -- | |
| pLV3-puro-SLC7A5 (P48869)质粒 | Miaoling Biotech | -- | |
| pLVX-YAP S127A/3YE质粒 | Sangon Biotech | -- | |
| pCDH-GFP载体 | -- | -- | |
| pMKO.1-hygro载体 | Addgene | -- | |
| pLKO.1-puro载体 | Addgene | -- | |
| 病毒包装 | 转染试剂 (Polyplus) | Polyplus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件：H358、SW1573等细胞系来自ATCC或ECACC，培养基RPMI 1640或DMEM，补充10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。 阅读提示：Methods 的 'Cell lines and cell culture' 部分 |
| 耐药细胞系构建 | H358R通过AMG510浓度递增（0.1μM至1μM）诱导约6个月；H358R N20通过口服30mg/kg AMG510的异种移植模型；HPAFIIR通过MRTX1133浓度递增（0.01μM至0.1μM）诱导约4个月。 阅读提示：Methods 的 'Generation of resistant cancer cell lines' 部分 |
| 基因敲低和过表达 | YAP/TAZ和TEADs的敲低通过shRNA或siRNA，过表达通过慢病毒载体；敲低效率需通过免疫印迹验证。 阅读提示：Methods 的 'Construction of plasmids and generation of stable cells' 和 'siRNA transfection' 部分 |
| 细胞活力测定 | 细胞以3×10^3至5×10^3个/孔接种96孔板，处理3-5天；CCK-8孵育1-4小时，测量450nm吸光度。 阅读提示：Methods 的 'Cell viability and synergy score' 部分 |
| 动物实验 | 使用雌性小鼠，每组5只；AMG510 30mg/kg每日口服；肿瘤体积和体重监测；Ki67和cleaved caspase-3免疫组化。 阅读提示：Methods 的 'Study approval' 部分和Figure Legends 8 |