建立CPZ/Rap脱髓鞘模型
建立脱髓鞘动物模型以模拟多发性硬化相关的髓鞘损伤。
给6周龄雄性野生型小鼠喂食含0.2%铜宗的饮食6周，同时每日腹腔注射雷帕霉素（10 mg/kg）。
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建立脱髓鞘动物模型以研究成年啮齿动物海马神经发生和认知功能的实验方案
Protocol to establish a demyelinated animal model to study hippocampal neurogenesis and cognitive function in adult rodents.
实验完整度
中提供了完整的实验步骤，包括模型建立、病毒包装、立体注射、行为学和免疫荧光，但未包含功能验证或机制验证。
主要模型
C57BL/6N小鼠 HEK293T细胞
重点核对
CPZ饮食浓度为0.2%，饲喂6周 雷帕霉素剂量10 mg/kg/天，腹腔注射 BrdU剂量50 mg/kg，连续4天腹腔注射 EdU剂量100 mg/kg，腹腔注射后2小时取材 立体注射坐标：AP -2.0 mm，ML ±1.7 mm，DV -1.9 mm
摘要
认知功能障碍是多发性硬化症（一种慢性炎症性脱髓鞘疾病）的普遍特征，可能与成年海马神经发生受损有关。在此，我们提出一个详细的方案，用于诱导铜宗（cuprizone）脱髓鞘小鼠以评估认知功能，并探讨脱髓鞘海马中认知缺陷的精确机制。我们描述了行为测试、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和溴脱氧尿苷（BrdU）给药、逆转录病毒包装和立体定位注射、海马组织制备以及免疫荧光染色的步骤。有关此方案的完整使用和执行细节，请参阅Song等人的文献1。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何建立脱髓鞘动物模型以研究海马神经发生和认知功能，并探究其机制？
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- CPZ/Rap处理导致髓鞘蛋白MBP和PLP减少，少突胶质细胞数量下降，NSC增殖和分化受抑，新生神经元树突复杂度和树突棘密度降低，MWM和RMWM测试显示空间记忆受损。
- 研究意义
- CPZ/Rap诱导的脱髓鞘小鼠模型可作为研究脱髓鞘海马中认知和神经发生变化的工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测NSC增殖和分化
评估脱髓鞘对神经干细胞增殖和分化的影响。
通过EdU和BrdU标记检测增殖和分化，分别于CPZ/Rap处理6周后注射EdU，处理2周后连续4天注射BrdU，并进行免疫荧光染色。
标记并分析新生神经元发育
研究脱髓鞘对新生神经元形态发育的影响。
通过立体定位注射表达RFP的逆转录病毒标记新生神经元，4周后取材，用Sholl分析和树突棘密度分析评估树突长度、复杂性和棘密度。
行为测试评估认知功能
评估脱髓鞘对空间记忆的影响。
在CPZ/Rap处理6周后进行Morris水迷宫和反向Morris水迷宫测试，记录逃逸潜伏期和平台穿越次数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光染色 | 大鼠抗BrdU抗体 | Abcam | 6326 |
| 小鼠抗GFAP抗体 | Cell Signaling Technology | 3670S | |
| 兔抗DCX抗体 | Cell Signaling Technology | 14802S | |
| 兔抗NeuN抗体 | Abcam | 177487 | |
| 兔抗Sox2抗体 | Abcam | 97959 | |
| 兔抗RFP抗体 | MBL | PM005 | |
| 兔抗MBP抗体 | Cell Signaling Technology | 78896S | |
| 兔抗PLP抗体 | Cell Signaling Technology | 28702 | |
| 兔抗Ng2抗体 | Sigma-Aldrich | AB5320 | |
| 小鼠抗CC1抗体 | Sigma-Aldrich | OP80 | |
| 山羊抗兔647抗体 | Invitrogen | A-21245 | |
| 山羊抗小鼠647抗体 | Invitrogen | A-21235 | |
| 山羊抗大鼠568抗体 | Invitrogen | A-11077 | |
| 山羊抗兔568抗体 | Invitrogen | A-11011 | |
| 山羊抗兔488抗体 | Invitrogen | A-11008 | |
| 山羊抗小鼠488抗体 | Invitrogen | A-11001 | |
| EdU检测 | EdU细胞增殖试剂盒 | Beyotime | ST067 |
| 细胞培养 | 山羊血清 | Gibco | 16210072 |
| 病毒包装 | Opti-MEM I减血清培养基 | Gibco | 31985070 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Wisent | 319-005-CL |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Gibco | 14190136 | |
| 灌注 | 磷酸盐缓冲液 | Gibco | C10010500BT |
| 细胞培养 | 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 |
| 动物护理 | 红霉素眼膏 | Baiyunshan | 212020050 |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | PAN-Seratech | ST30-3302 |
| 病毒包装 | 聚乙烯亚胺 | Proteintech Group | PR40001 |
| BrdU注射 | 溴脱氧尿苷 | Sigma | B9285 |
| 麻醉 | 异氟烷 | RWD | R510-22-10 |
| PVA-DABCO溶液 | Tris-HCl | Sigma | T3253 |
| 封片 | PVA-聚乙烯醇 | Sigma | p8136 |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| 溶液配制 | 无水磷酸二氢钠 | Solarbio | S5141 |
| 无水磷酸氢二钠 | Solarbio | D9790 | |
| 冷冻保护剂 | 甘油 | Fisher | G33-1 |
| 乙二醇 | Sigma | 324558 | |
| 灌注 | 0.9%生理盐水 | Procell | PB180353 |
| 免疫荧光染色 | DAPI核酸染色液 | Sigma-Aldrich | D9542 |
| 通透 | Triton X-100 | Beyotime | ST79 |
| 细胞培养 | HEK293T细胞 | ATCC | -- |
| 动物实验 | C57BL/6N小鼠，6周龄，雄性 | Charles River | Strain |
| 立体定位注射 | 69100旋转数字立体定位仪（小鼠和大鼠） | RWD | K69100 |
| KDS Legato 130注射泵 | RWD | KDS | |
| 钻 | RWD | 78001 | |
| 麻醉 | 啮齿动物麻醉机 | RWD | R500 |
| 立体定位注射 | 注射器支架 | RWD | 68218 |
| 灌注 | 1 mL注射器 | KDL | 60017031 |
| 样品存储 | 1.5 mL微量离心管 | Axygen | MCT-500-C-S |
| 细胞培养 | 15 mL离心管 | Corning | CLS430055 |
| 50 mL离心管 | Corning | 430291 | |
| 75 cm2培养瓶 | Corning | 430720 | |
| 病毒浓缩 | 离心管 | Backman Coulter | 344058 |
| 超速离心机 | Backman Coulter | Optima | |
| 溶液混匀 | 涡旋混合器 | Gilson | 36110740 |
| 动物实验 | 动物平台 | RWD | 68607 |
| 手术 | 精细剪刀 | RWD | S12003 |
| 手术刀柄 | RWD | S32001 | |
| 精细镊子 | RWD | F12010 | |
| 止血钳 | RWD | F21011 | |
| 持针器 | RWD | F31031 | |
| 动物护理 | 加热垫 | Nuansandong | CDT30X35 |
| 缝合 | 缝合线 | RWD | F35305-50 |
| 缝合针 | RWD | F35401-50 | |
| 钻孔 | 钻头 | RWD | 78041 |
| 剃毛 | 电动剃毛器 | BDL | K9 |
| 立体定位注射 | 微量注射器 | Hamilton | 87943 |
| 微量注射器针头 | Hamilton | 780305 | |
| 手术 | 棉签 | Winner | 601-020764-01 |
| 细胞培养 | 150 mm培养皿 | Corning | 430599 |
| 过滤 | 真空过滤/储存瓶系统 | Biosharp | BS-QT-037 |
| 称量 | 电子天平 | Yingheng | YHM-10002Y |
| 脑片制备 | 滑动切片机 | Thermo Scientific | HM430 |
| 药物处理 | 铜宗 | Sigma-Aldrich | C9012-25G |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CPZ饮食配制 | CPZ浓度0.2%，储存条件4°C 阅读提示：Before you begin 步骤1 |
| 雷帕霉素溶液配制 | 储存液浓度10 mg/mL，工作液浓度0.5 mg/mL，溶剂10% DMSO+90%玉米油 阅读提示：Before you begin 步骤2 |
| 病毒包装 | 293T细胞汇合度80%，DNA与PEI比例1 μg:2.5 μL，转染后5小时更换培养基 阅读提示：Step-by-step method details 步骤4-11 |
| 立体定位注射 | 坐标AP -2.0 mm，ML ±1.7 mm，DV -1.9 mm，注射体积1 μL，速率0.5 μL/min 阅读提示：Step-by-step method details 步骤12-22，图1B |
| BrdU注射 | 剂量50 mg/kg，连续4天，腹腔注射 阅读提示：Step-by-step method details 步骤23-24 |
| EdU注射 | 剂量100 mg/kg，腹腔注射，2小时后取材 阅读提示：Step-by-step method details 步骤25 |
| 行为测试 | MWM和RMWM测试，平台穿越次数和逃逸潜伏期，每组10只动物 阅读提示：Step-by-step method details 行为评估部分，图4 |