筛选调控NRF2稳定性的DUB
在HEK293T细胞中泛素化/蛋白酶体依赖的NRF2降解背景下，筛选出能够提高NRF2蛋白水平的去泛素化酶。
将NRF2质粒与56个DUB表达质粒逐一共转染293T细胞，36小时后收集细胞裂解，通过Western blot检测NRF2蛋白水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
去泛素化酶USP35调控NRF2蛋白的稳定性
The deubiquitinating enzyme USP35 regulates the stability of NRF2 protein.
实验完整度
中文献包含细胞模型上的分子机制验证（相互作用、去泛素化、稳定性）和功能验证（化疗敏感性），但未涉及动物模型或患者样本，属于中等实验完整度。
主要模型
HEK293T细胞 食管癌细胞系ECA-109、TE-1、KYSE-410
重点核对
筛选实验共转染56种DUB表达质粒与NRF2，检测NRF2蛋白水平变化 USP35酶活突变体C450S及其酶活结构域（aa 421-1018）对NRF2稳定性的影响 CHX处理浓度40 μg/mL及时间点检测NRF2蛋白半衰期 MG132处理浓度10 μM，处理6小时用于泛素化实验 ECA-109细胞中USP35敲低和NRF2敲除对顺铂敏感性的影响（处理48小时）
摘要
许多癌症表现出对化疗的耐药性，导致预后不良。转录因子NRF2响应细胞抗氧化剂而被激活，在细胞存活、增殖和化疗耐药中发挥关键作用。该因子可能作为食管癌治疗干预的一个有前景的靶点。近期研究表明，NRF2活性受KEAP1-CUL3 E3连接酶复合物介导的泛素化调控，突出了去泛素化的重要性。然而，在食管癌中调控NRF2的特异性去泛素化酶仍然未知。在本研究中，鉴定出NRF2蛋白的一个新型调控因子，即泛素特异性蛋白酶35（USP35）。在机制上，USP35通过酶促去泛素化调控NRF2的稳定性。USP35与NRF2相互作用并促进其去泛素化。敲低USP35导致NRF2水平显著升高，并增强细胞对化疗的敏感性。这些发现表明，USP35-NRF2轴在食管癌治疗策略的调控中是一个关键角色。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在食管癌细胞中，哪个去泛素化酶调控NRF2蛋白的稳定性，并影响化疗敏感性？
- 核心机制
- USP35通过其酶活与NRF2相互作用并去泛素化NRF2，从而抑制NRF2的蛋白酶体降解，稳定NRF2蛋白，进而增强食管癌细胞对顺铂的耐药性。
- 主要证据
- 在HEK293T和食管癌细胞系中，过表达USP35增加NRF2蛋白水平但不影响mRNA水平，敲低USP35降低NRF2蛋白水平；USP35酶活突变体C450S无此作用；免疫共沉淀显示USP35与NRF2相互作用，泛素化实验显示USP35去除NRF2的泛素链；在ECA-109细胞中，USP35过表达或NRF2过表达降低顺铂的细胞毒性，而USP35敲低或NRF2敲除增加顺铂敏感性。
- 研究意义
- 研究结果为食管癌化疗耐药提供了新的机制见解，USP35-NRF2轴可能成为克服食管癌化疗耐药的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证USP35对NRF2蛋白稳定性的调控
验证USP35是否特异性调控NRF2蛋白水平及稳定性。
在ECA-109和TE-1细胞中过表达或敲低USP35，检测NRF2蛋白和mRNA水平；使用CHX处理检测NRF2蛋白半衰期。
验证USP35酶活及其结构域对NRF2稳定性的作用
确定USP35的酶活性和特定结构域是否为其调控NRF2稳定性所必需。
在ECA-109和HEK293T细胞中过表达USP35酶活突变体C450S及截短突变体（aa 1-420，aa 421-1018），检测NRF2蛋白水平；并用CHX实验比较野生型与突变体对NRF2稳定性的影响。
验证USP35与NRF2的相互作用及去泛素化
验证USP35是否与NRF2直接相互作用，并去泛素化NRF2。
在293T细胞中共转染USP35-Flag和NRF2-HA，进行免疫共沉淀实验；共转染USP35、NRF2-HA和Flag-Ub，MG132处理6小时后用抗HA抗体进行免疫沉淀，用抗Flag抗体检测NRF2的泛素化水平。
验证USP35介导的化疗耐药功能
验证USP35是否通过上调NRF2导致食管癌细胞对化疗药物耐药。
构建稳定过表达USP35或NRF2的ECA-109细胞系、NRF2敲除细胞系及USP35敲低细胞系，并用NRF2敲除细胞系回补NRF2或USP35；用不同浓度顺铂处理48小时，检测细胞活力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| Western blot | 抗USP35抗体 | Proteintech | 24559-1-AP |
| 抗NRF2抗体 | Proteintech | 16396-1-AP | |
| 抗Flag抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| 抗HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 抗MYC抗体 | Proteintech | 16286-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 细胞凋亡检测 | Caspase-Glo 3/7检测试剂盒 | Promega | -- |
| 药物处理 | MG-132 | MCE | -- |
| 顺铂 | MCE | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Beyotime | -- |
| SYBR Green qPCR试剂盒 | TIANGEN | -- | |
| 转染 | EL转染试剂 | Transgene | -- |
| 基因克隆 | 核酸外切酶III | Takara | -- |
| 基因编辑 | lentiCRISPRv2载体 | Addgene | #52961 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分（DMEM、10% FBS、100 mg/ml链霉素、100 IU青霉素、4 mM L-谷氨酰胺）、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：见Methods 2.1 Cell culture |
| 筛选实验 | 共转染的DUB表达质粒及NRF2质粒、转染试剂、转染后时间（36小时） 阅读提示：见Methods 2.5 Transfection and DUBs screening 及 Figure 1b legend |
| 蛋白稳定性实验 | CHX浓度（40 μg/mL）、处理时间点、细胞系 阅读提示：见Figure 1f和2c的图注 |
| 泛素化实验 | MG132浓度（10 μM）、处理时间（6小时）、质粒组合（NRF2-HA、Flag-Ub、USP35及突变体）、免疫沉淀抗体（抗HA beads） 阅读提示：见Methods 2.7 Ubiquitination assays |
| 化疗敏感性实验 | 顺铂浓度梯度、处理时间（48小时）、细胞系（ECA-109各种稳定系）、细胞接种密度（2.5×10^4/96孔） 阅读提示：见Methods 2.9 Cell viability assay 及 Figure 4 legend |