体外纤维化模型建立及hsa_circ_0001861表达检测
验证TGF-β处理是否下调hsa_circ_0001861表达，以及过表达载体是否有效上调其水平。
用人肺成纤维细胞，经TGF-β（5 ng/mL）处理48小时诱导纤维化模型，并转染pcDNA3.1-hsa_circ_0001861（OE）或空载体（NC）48小时，通过RT-qPCR检测hsa_circ_0001861表达。
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hsa_circ_0001861的过表达通过靶向miR-296-5p/BCL-2结合成分3轴抑制肺纤维化
Overexpression of hsa_circ_0001861 inhibits pulmonary fibrosis through targeting miR-296-5p/BCL-2 binding component 3 axis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（增殖、迁移、凋亡、蛋白检测）、RNA pull-down和双荧光素酶报告实验、体内小鼠模型及组织学分析，且进行功能验证和机制验证。
主要模型
人肺成纤维细胞 293T细胞 C57BL/6小鼠肺纤维化模型（博来霉素诱导）
重点核对
TGF-β处理浓度5 ng/mL，处理48小时 hsa_circ_0001861过表达载体（pcDNA3.1-hsa_circ_0001861）转染48小时 BBC3敲低采用shRNA慢病毒感染，并使用嘌呤霉素（2.5 μg/mL）筛选 CCK-8实验细胞密度为10,000细胞/孔，EdU实验为2×10^4细胞，TUNEL染色使用TUNEL试剂A和B 动物实验中博来霉素剂量1 unit/kg，气管内注射50 μL，hsa_circ_0001861过表达慢病毒颗粒1x10^11载体，给药后3天
摘要
肺纤维化是一种进行性肺部疾病。已有证据表明hsa_circular(circ)RNA_0001861在肺纤维化中表达失调。然而，hsa_circRNA_0001861在肺纤维化中的详细功能仍未被探索。为了研究hsa_circRNA_0001861在肺纤维化中的作用，使用人肺成纤维细胞进行体外实验，并通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)染色分别评估细胞活力和增殖。采用Western blot分析和逆转录定量PCR(RT-qPCR)评估蛋白和mRNA水平。同时，通过RNA pull-down实验研究了hsa_circRNA_0001861、miR-296-5p和BCL-2结合成分3(BBC3)之间的关系。此外，构建了体内肺纤维化模型以评估hsa_circRNA_0001861在肺纤维化中的作用。数据显示，TGF-β1显著增加肺成纤维细胞的增殖，而hsa_circRNA_0001861的过表达显著消除了这一现象。hsa_circRNA_0001861过表达通过介导α-平滑肌肌动蛋白、E-钙黏蛋白、III型胶原和纤连蛋白1，显著抑制了TGF-β1诱导的肺成纤维细胞纤维化。同时，hsa_circRNA_0001861可以与miR-296-5p结合，BBC3被确定为miR-296-5p的下游mRNA。此外，hsa_circRNA_0001861的上调通过上调BBC3明显逆转了TGF-β1诱导的肺成纤维细胞纤维化和增殖。此外，hsa_circRNA_0001861上调在体内显著减轻了肺纤维化。hsa_circRNA_0001861上调通过调节miR-296-5p/BBC3轴减轻了肺纤维化。因此，本研究可能为发现对抗肺纤维化的新方法提供一些见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨hsa_circ_0001861在肺纤维化中的具体作用及其分子机制。
- 核心机制
- hsa_circ_0001861作为miR-296-5p的分子海绵，上调其下游靶基因BBC3，从而抑制TGF-β诱导的肺成纤维细胞增殖和纤维化，并在体内减轻博来霉素诱导的肺纤维化。
- 主要证据
- 体外实验显示hsa_circ_0001861过表达逆转TGF-β诱导的肺成纤维细胞增殖、迁移和纤维化蛋白（α-SMA、胶原I、纤连蛋白）表达上调，诱导细胞凋亡；RNA pull-down和双荧光素酶实验证实hsa_circ_0001861直接结合miR-296-5p，且BBC3为miR-296-5p的直接靶标；BBC3敲低可逆转hsa_circ_0001861的效应。体内实验显示hsa_circ_0001861过表达减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化和炎症浸润。
- 研究意义
- 本研究首次阐明hsa_circ_0001861在肺纤维化中的作用及其机制，为肺纤维化治疗新策略的发现提供理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞增殖和活力检测
评估hsa_circ_0001861过表达对TGF-β诱导的成纤维细胞增殖和活力的影响。
用CCK-8和EdU染色检测细胞活力和增殖，比较对照组、TGF-β组、TGF-β+NC组和TGF-β+OE组。
细胞迁移检测
评估hsa_circ_0001861过表达对TGF-β诱导的成纤维细胞迁移的影响。
通过伤口愈合实验检测细胞迁移，比较不同处理组的迁移面积。
纤维化相关蛋白表达检测
检测hsa_circ_0001861过表达对TGF-β诱导的纤维化标志物蛋白表达的影响。
Western blot检测α-SMA、E-cadherin、胶原III、纤连蛋白和β-actin蛋白水平。
靶向关系验证
验证hsa_circ_0001861与miR-296-5p的相互作用，以及miR-296-5p与BBC3的靶向关系。
利用数据库预测，并采用双荧光素酶报告实验和RNA pull-down验证结合。
机制验证
验证hsa_circ_0001861通过上调BBC3介导其抑制纤维化的作用。
在成纤维细胞中敲低BBC3，检测细胞增殖、凋亡及纤维化蛋白表达的变化。
体内验证
评估hsa_circ_0001861过表达对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响。
建立博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，通过气管内注射hsa_circ_0001861过表达慢病毒，通过组织学染色评估纤维化程度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| 青霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| 链霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| 药物处理 | 转化生长因子-β | R&D system | No. 7754-BH |
| 博来霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | Gibco | A1113802 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Takara Bio, Inc. | -- |
| 逆转录 | EntiLink™试剂盒 | ELK Biotechnology, Co. Ltd. | EQ003 |
| RT-qPCR | SYBR Green荧光染料 | 文中未明确说明 | -- |
| 安捷伦系统 | Agilent Technologies, Inc. | -- | |
| CCK-8实验 | 细胞计数试剂盒-8 | Beyotime Institute of Biotechnology | C0038 |
| 酶标仪 | Wuxi Hiwell-Diatek Instruments Co., Ltd. | DR-200Bs | |
| EdU染色 | EdU细胞增殖试剂盒 | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | C10310-1 |
| DAPI染色液 | 文中未明确说明 | -- | |
| 荧光显微镜 | Olympus Co. | IX51 | |
| 双荧光素酶实验 | pmiRRB-Report™载体 | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | -- |
| Lipofectamine® 2000转染试剂 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| 双荧光素酶系统 | Promega Co. | -- | |
| RNA pull-down | 链霉亲和素偶联磁珠 | 文中未明确说明 | -- |
| TUNEL染色 | TUNEL试剂A和B | Roche | 11684817910 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- | |
| SDS凝胶(10%) | 文中未明确说明 | -- | |
| PVDF膜 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| 抗α-SMA抗体 | Abcam | ab108531 | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | Abcam | ab40772 | |
| 抗III型胶原抗体 | Abcam | ab184993 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8226 | |
| 抗纤连蛋白1抗体 | Abcam | ab2413 | |
| HRP标记二抗 | Abcam | ab288151 | |
| 增强化学发光检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | NCI5079 | |
| 免疫组化 | 抗I型胶原抗体 | Abcam | ab138492 |
| 抗α-SMA抗体 | Abcam | ab124964 | |
| 二抗 | Aspen Biosciences | AS-1107 | |
| 组织学分析 | Masson三色染色液 | 文中未明确说明 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：人肺成纤维细胞来源（Procell Life Science & Technology Co., Ltd.），293T细胞（ATCC）；培养基：DMEM + 10% FBS + 青霉素(100 U/mL) + 链霉素(100 μg/mL)；培养条件：37°C，5% CO2 阅读提示：Materials and Methods, Cell culture |
| TGF-β处理 | TGF-β浓度：5 ng/mL；处理时间：48小时 阅读提示：Materials and Methods, Cell culture; Figure 1 legend |
| 转染与敲低 | 过表达载体：pcDNA3.1-hsa_circ_0001861（OE）或pcDNA3.1（NC）转染48小时；BBC3敲低：shRNA慢病毒感染，嘌呤霉素筛选浓度2.5 μg/mL 阅读提示：Materials and Methods, Cell transfection |
| 增殖检测 | CCK-8：细胞密度10,000/孔，处理24、48、72小时，CCK-8 10 μL，孵育2小时，测450 nm；EdU：2×10^4细胞，EdU浓度5 μM，孵育2小时；DAPI染色5分钟 阅读提示：Materials and Methods, CCK-8 assay, EdU staining; Figure 1C, D |
| 迁移检测 | 细胞密度5×10^5/孔，划痕后无血清DMEM培养，转染pcDNA3.1-hsa_circ_0001861，48小时后观察，用ImageJ分析 阅读提示：Materials and Methods, Wound healing assay; Figure 2A |
| 分子结合验证 | 双荧光素酶：WT/MUT-hsa_circ_0001861及BBC3载体，miR-296-5p agomir共转染48小时；RNA pull-down：生物素标记探针，磁珠孵育6小时 阅读提示：Materials and Methods, Dual luciferase assay, RNA pull-down; Figures 3B, 4B |
| 蛋白检测 | Western blot：蛋白裂解用RIPA，定量BCA，10% SDS凝胶，PVDF膜，一抗浓度1:1000，二抗1:5000，ECL检测 阅读提示：Materials and Methods, Western blot assay |
| 动物模型 | 小鼠：雄性C57BL/6，20只，18-22g，9-12周；BLM剂量：1 unit/kg，气管内注射50 μL；hsa_circ_0001861慢病毒颗粒1x10^11载体，BLM后3天；异氟烷麻醉；CO2处死 阅读提示：Materials and Methods, Animal study; Figure 7 |
| 组织学分析 | 固定：4%多聚甲醛过夜；石蜡包埋；切片厚度5 μm；H&E和Masson染色；免疫组化：一抗collagen I (1:200)和α-SMA (1:200)，二抗孵育50分钟 阅读提示：Materials and Methods, Immunohistochemical staining, Histology and fibrosis analysis; Figure 7 |