CircRNA LDLR promotes proliferation and aerobic glycolysis of gastric cancer cells by targeting CHD1 with miR-449b-5p.
包含临床样本表达分析、体外细胞功能实验、机制验证（RIP、双荧光素酶报告基因）及体内异种移植瘤模型等多层级证据。
胃癌细胞系MKN-45 胃癌细胞系AGS 人正常胃黏膜细胞系GES-1 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型
细胞系：MKN-45（胃癌）、AGS（胃癌）、GES-1（正常胃黏膜） 转染：circLDLR过表达质粒、si-circLDLR、miR-449b-5p mimic、si-CHD1及各自阴性对照，使用Lipofectamine 2000转染48小时 体内实验：BALB/c雌性裸鼠（6周龄），每组4只，皮下注射5×10^6个si-circLDLR转染的MKN-45细胞 检测指标：葡萄糖摄取、乳酸生成、ATP/ADP比值、NAD+/NADH比值、Ki-67免疫组化
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测circLDLR在胃癌组织和细胞系中的表达水平及其临床相关性。
收集43对胃癌组织和癌旁正常组织，用定量PCR检测circLDLR表达；在胃癌细胞系AGS、MKN-45和正常胃黏膜细胞GES-1中检测circLDLR；分析circLDLR表达与临床病理特征的关系；利用circBank预测circLDLR结构；RNAse R和放线菌素D实验验证其环状结构和稳定性；亚细胞分离实验确定其亚细胞定位。
验证circLDLR是否影响胃癌细胞的增殖和凋亡。
在MKN-45细胞中转染circLDLR过表达质粒或si-circLDLR，通过CCK-8和EdU实验检测细胞增殖，通过流式细胞术检测凋亡。
研究circLDLR是否调节胃癌细胞的有氧糖酵解。
在MKN-45细胞中敲低或过表达circLDLR后，检测葡萄糖摄取、乳酸生成、ATP/ADP比值和NAD+/NADH比值。
验证circLDLR是否作为miRNA海绵与miR-449b-5p结合。
通过starBase3.0预测结合位点，使用RIP实验验证Ago2富集，通过双荧光素酶报告基因实验验证circLDLR与miR-449b-5p的相互作用，并检测circLDLR表达变化对miR-449b-5p水平的影响。
确认CHD1是miR-449b-5p的直接靶基因。
通过starBase3.0预测靶基因，并在TNMplot数据库分析表达模式；在胃癌细胞中检测CHD1表达；使用双荧光素酶报告基因验证miR-449b-5p与CHD1 3'UTR的结合；检测circLDLR和miR-449b-5p对CHD1蛋白表达的影响。
验证miR-449b-5p或CHD1下调能否逆转circLDLR过表达引起的细胞表型变化。
将circLDLR-OE与miR-449b-5p mimic共转染，或circLDLR-OE与si-CHD1共转染至MKN-45细胞，然后检测细胞增殖、凋亡和有氧糖酵解相关指标。
验证circLDLR在体内是否影响肿瘤形成和生长。
将si-circLDLR转染的MKN-45细胞皮下注射到裸鼠，定期测量肿瘤体积，4周后处死，称重，并通过免疫印迹检测CHD1水平，免疫组化检测Ki-67。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| Ham's F-12培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Procell | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 定量PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| SuperScript III逆转录酶 | Invitrogen | -- | |
| SYBR Green预混液 | CloudSeq | -- | |
| TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| TaqMan通用预混液II | Applied Biosystems | -- | |
| AB7500实时定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA稳定性 | RNA酶R | Epicentre Technologies | -- |
| 亚细胞分离 | PARIS试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 免疫印迹 | 裂解缓冲液 | Beyotime | -- |
| Bradford蛋白浓度测定试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| GAPDH抗体 | CST | 2118 | |
| CHD1抗体 | CST | 4351 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | CST | -- | |
| 增强型ECL化学发光试剂盒 | ultrassignal | -- | |
| 细胞增殖 | CCK-8溶液 | Dojindo | -- |
| BeyoClick EdU细胞增殖试剂盒 | Beyotime | -- | |
| Alexa Fluor 555荧光染料 | Beyotime | -- | |
| Hoechst 33342染料 | -- | -- | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | FLUOVIEW | |
| 有氧糖酵解检测 | 葡萄糖检测试剂盒 | BioVision | -- |
| 乳酸检测试剂盒 | BioVision | -- | |
| ApoSENSOR ADP/ATP比值检测试剂盒 | BioVision | -- | |
| EnzyLight NAD+/NADH比值检测试剂盒 | Bioassay Systems | -- | |
| SpectraMax酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Solarbio | CA1020 |
| FACScan流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | pmirGLO荧光素酶报告载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | -- | |
| Synergy 2多功能酶标仪 | BioTek | -- | |
| RNA免疫沉淀 | EZ-Magna RIP试剂盒 | Millipore | -- |
| 动物实验 | Ki-67抗体 | Abcam | ab15580 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本 | 胃癌组织和癌旁正常组织的配对数量（43对）及收集条件（液氮速冻） 阅读提示：参见Materials and methods 2.1 Clinical samples |
| 细胞培养 | 细胞系来源（MKN-45、AGS、GES-1）及培养条件（培养基、温度、CO2浓度） 阅读提示：参见Materials and methods 2.2 Cell culture |
| 细胞转染 | 转染试剂（Lipofectamine 2000）及转染时长（48小时） 阅读提示：参见Materials and methods 2.3 Cell transfection |
| 定量PCR | RNA提取试剂、逆转录试剂、PCR体系及内参基因（U6、GAPDH） 阅读提示：参见Materials and methods 2.4 Quantitative PCR及Table 1 |
| circLDLR稳定性检测 | RNAse R处理条件和放线菌素D浓度（2 μg/mL）及检测时间点（0,4,8,12,24h） 阅读提示：参见Materials and methods 2.5 RNAse R treatment和2.6 Actinomycin D assay |
| 亚细胞定位 | 细胞数量（1×10^6）及参照基因（18S、U6） 阅读提示：参见Materials and methods 2.7 Subcellular isolation assay |
| 蛋白检测 | 抗体信息（GAPDH #2118, CHD1 #4351, CST）、裂解液及ECL试剂 阅读提示：参见Materials and methods 2.8 Immunoblot analysis |
| 细胞增殖 | CCK-8和EdU实验的细胞密度、处理时间及检测条件 阅读提示：参见Materials and methods 2.9 CCK-8和2.10 EdU experiment |
| 有氧糖酵解 | 葡萄糖摄取、乳酸、ATP/ADP、NAD+/NADH检测的细胞密度、孵育时间及试剂盒 阅读提示：参见Materials and methods 2.11-2.13 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI双染步骤及流式细胞仪 阅读提示：参见Materials and methods 2.14 Apoptosis assay |
| 双荧光素酶报告基因 | 报告基因载体（pmirGLO）、细胞系及检测时间（48h） 阅读提示：参见Materials and methods 2.15 Luciferase reporter assay |
| RIP实验 | Ago2抗体、磁珠及孵育条件（4°C 6小时） 阅读提示：参见Materials and methods 2.16 RNA binding protein immunoprecipitation (RIP) experiment |
| 动物实验 | 小鼠品系（BALB/c雌性裸鼠，6周龄）、每组数量（4只）、注射细胞数（5×10^6）及观察时间（4周） 阅读提示：参见Materials and methods 2.17 Xenotransplantation |
