构建重组病毒
生成野生型及PL1pro缺失的IBV重组病毒，以研究PL1pro功能。
通过RT-PCR获得覆盖IBV基因组的五个片段，体外连接组装全长cDNA，经体外转录和电转染Vero细胞拯救病毒，并验证病毒恢复。
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IBV PL1pro在病毒复制和宿主先天免疫应答抑制中的作用
The role of IBV PL1pro in virus replication and suppression of host innate immune responses.
实验完整度
高利用反向遗传构建重组病毒，进行病毒生长动力学、斑块测定、IFN敏感性、IFN-β表达、STAT1磷酸化及ISG表达等体外功能验证，并过表达验证机制。
主要模型
H1299细胞 Vero细胞
重点核对
重组病毒构建：删除PL1pro（3022-3540 nt）或PL1pro-N（3022-3213 nt） 细胞系：Vero（IFN缺陷）和H1299（IFN感受态） 感染复数（MOI）：0.5 IFN-α预处理浓度：50, 100, 150 ng/ml，处理2小时 检测时间点：0, 4, 8, 16, 24, 36, 48小时感染后
摘要
背景：冠状病毒木瓜样蛋白酶（PLpros）在病毒复制和逃避宿主免疫应答中发挥关键作用。传染性支气管炎病毒（IBV）编码一个蛋白水解缺陷的PL1pro残基和一个有活性的PL2pro。然而，PL1pro在IBV中的功能在很大程度上仍是未知的。本研究旨在探讨PL1pro对病毒复制的影响及其潜在机制。结果：通过反向遗传技术删除IBV PL1pro结构域和PL1pro的N端保守序列（PL1pro-N），获得了重组病毒rIBV-ΔPL1pro和rIBV-ΔPL1pro-N。我们观察到rIBV-ΔPL1pro和rIBV-ΔPL1pro-N的复制显著低于野生型IBV。进一步研究表明，IBV中PL1pro-N的缺失降低了病毒对干扰素（IFN）的抵抗力，同时通过增强IFN-β的产生和激活IFN下游STAT1信号通路来诱导宿主免疫应答。此外，PL1pro-N的过表达通过下调IFN通路中基因的表达显著抑制I型IFN应答。结论：我们的数据表明，IBV PL1pro在IBV复制和宿主先天免疫应答的抑制中发挥关键作用，提示IBV PL1pro可能作为抗病毒治疗的有希望的分子靶点。补充信息：在线版本包含补充材料，可在10.1186/s12917-023-03839-2获取。关键词：传染性支气管炎病毒，木瓜样蛋白酶，病毒复制，干扰素，免疫应答
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IBV PL1pro（特别是其N端区域）对病毒复制和宿主先天免疫应答的影响及其机制。
- 核心机制
- IBV PL1pro-N通过抑制IFN-β产生和STAT1磷酸化及核转位，从而抑制I型IFN信号通路，促进病毒复制。
- 主要证据
- 删除PL1pro或PL1pro-N的重组病毒在Vero和H1299细胞中复制减弱；IFN-α敏感性增加；IFN-β表达上调；STAT1磷酸化及IFIT1/IFIT2表达增强；PL1pro-N过表达下调IFN通路相关基因表达。
- 研究意义
- 揭示了IBV PL1pro作为抗病毒治疗的潜在分子靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估病毒复制能力
检测PL1pro缺失对病毒生长和细胞病变的影响。
在Vero和H1299细胞中感染重组病毒，进行斑块形成实验、生长动力学测定和IBV N蛋白表达检测。
IFN敏感性检测
评估PL1pro-N缺失对病毒抵抗IFN能力的影响。
用不同浓度IFN-α预处理H1299细胞，然后感染rIBV或rIBV-ΔPL1pro-N，通过免疫荧光和Western blot检测病毒复制。
分析IFN-β产生
检测PL1pro-N缺失对IFN-β表达的影响。
感染后不同时间点收集细胞裂解液，Western blot检测IFN-β蛋白水平。
检测STAT1信号通路
探究PL1pro-N对IFN下游信号通路的影响。
感染后刺激IFN-α，Western blot检测STAT1和p-STAT1水平，免疫染色观察p-STAT1核转位。
检测ISG表达
验证PL1pro-N对IFN刺激基因（ISG）表达的影响。
感染后使用qRT-PCR和Western blot检测IFIT1和IFIT2的表达。
过表达PL1pro-N验证
验证PL1pro-N对IFN通路的负调控作用。
在H1299细胞中过表达PL1pro-N，然后感染rIBV，Western blot检测IFN-β、p-STAT1、IFIT1和IFIT2的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素 | Gibco | -- | |
| 链霉素 | Gibco | -- | |
| 转染 | TurboFect转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | R0531 |
| 质粒构建 | 限制性内切酶BsmB I | New England Biolabs | R0739S |
| 限制性内切酶Bsa I | New England Biolabs | R3733S | |
| T4连接酶 | New England Biolabs | E7664 | |
| 体外转录 | RiboMAX大规模RNA生产系统-T7 | Promega | -- |
| m7G(5')ppp(5')G RNA帽结构类似物 | New England Biolabs | S1404S | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Ambion | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 抗IBV-N抗体 | Yangtze University | -- | |
| 兔抗IFN-β多克隆抗体 | Proteintech | 27506-1-AP | |
| 兔抗STAT1多克隆抗体 | Proteintech | 10144-2-AP | |
| 兔抗IFIT1多克隆抗体 | Proteintech | 23247-1-AP | |
| 兔抗IFIT2多克隆抗体 | Proteintech | 12604-1-AP | |
| 兔抗磷酸化STAT1-Y701抗体 | Abcam | ab30645 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Sangon Biotech | -- | |
| 免疫荧光 | FITC标记的山羊抗兔IgG | ABclonal | AS011 |
| DAPI | ABclonal | RM02978 | |
| 显微镜 | Leica DM i8手动荧光显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组病毒构建 | cDNA片段组装方法，电转染参数（450V, 50µF），序列删除位置（3022-3540 nt和3022-3213 nt） 阅读提示：Materials and methods: Recovery of infectious viruses rIBV, rIBV-ΔPL1pro, and rIBV-ΔPL1pro-N |
| 细胞培养与感染 | 细胞系（Vero、H1299），培养基（DMEM+10%FBS），感染复数（MOI=0.5） 阅读提示：Materials and methods: Cells, viruses, and plasmids; Growth kinetics |
| IFN敏感性检测 | IFN-α预处理浓度（50, 100, 150 ng/ml）及时间（2小时），检测时间（感染后18小时） 阅读提示：Materials and methods: Interferon sensitivity assay |
| IFN-β和STAT1检测 | IFN-α刺激浓度（100 ng/ml）及时间（感染后6小时），检测时间点（12, 16, 20小时） 阅读提示：Materials and methods: Western blot; Results: The absence of the N-terminal region of PL1pro promotes the phosphorylation of STAT1 |
| ISG表达检测 | IFN-α刺激浓度（100 ng/ml）及时间（感染后6小时），检测时间点（16, 20小时） 阅读提示：Materials and methods: Reverse transcription (RT)-polymerase chain reaction (PCR) and real-time quantitative RT-PCR (RT-qPCR); Results: The absence of the N-terminal region of PL1pro up-regulates the expressions of IFIT family members |
| 过表达实验 | 转染试剂（TurboFect），质粒（pcDNA5-FLAG-PL1pro-N），转染时间（24小时后检测） 阅读提示：Materials and methods: Transfection; Results: Overexpression of IBV PL1pro-N downregulates the expressions of genes in the IFN pathway |