长链非编码RNA LINC01554过表达通过调控miR-148b-3p/EIF4E3抑制肝癌细胞的活力、迁移和侵袭

Long non-coding RNA LINC01554 overexpression suppresses viability, migration, and invasion of liver cancer cells through regulating miR-148b-3p/EIF4E3.

作者信息Xiaojing Ren, Xiaoxiao Wang, Huangqin Song, Chao Zhang, Junlong Yuan, Jiefeng He, Jianguo Li, Zhuangqiang Wang
PMID38501022
期刊Heliyon
发布时间2024-03-05
DOI10.1016/j.heliyon.2024.e27319

实验完整度

高

包含细胞模型(HCCLM3等)功能实验、双荧光素酶报告基因、临床组织样本验证及过表达/敲低和回复实验,多个独立证据层级。

主要模型

HCCLM3细胞 HepG2细胞 PLC/PRF/5细胞 临床肝癌组织样本

重点核对

LINC01554在肝癌细胞系中低表达,需验证过表达效率(约4000倍) miR-148b-3p mimics和inhibitor的浓度(20pM,100nM)及转染时间(6h后换液,48h检测) 双荧光素酶报告基因实验验证LINC01554-miR-148b-3p和miR-148b-3p-EIF4E3相互作用 细胞功能实验(CCK-8、流式、Transwell)的检测时间点(24h,48h,72h)和细胞密度(1×104,5×105)

摘要

背景:长链非编码RNA(lncRNAs)可作为竞争性内源RNA(ceRNAs)通过海绵吸附微小RNA(miRNAs)来调控靶基因或mRNAs。本研究探讨了LINC01554通过ceRNA机制对肝癌细胞的影响。方法:选取五个显著下调的lncRNAs进行进一步验证,然后通过生物信息学鉴定lncRNAs的相互作用miRNAs和mRNAs。通过双荧光素酶报告基因实验检测LINC01554、miR-148b-3p和EIF4E3之间的关系。随后,用pCDH-LINC01554、miR-148b-3p inhibitor和miR-148b-3p mimics转染HCCLM3细胞。用Cell Counting Kit-8、流式细胞仪和Transwell实验检测细胞活力、凋亡、迁移和侵袭。用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot检测相关基因和蛋白的表达。结果:LINC01554在肝癌细胞系中显著下调,并表达于HCCLM3细胞的细胞质中。LINC01554过表达抑制HCCLM3细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进其凋亡(P < 0.05)。此外,LINC01554过表达还显著增加了BAX、BCL2/BAX、P53、cleaved-Caspase3、TIMP3、E-cadherin和EIF4E3的水平(P < 0.05)。通过生物信息学和双荧光素酶报告基因实验,证明LINC01554、miR-148b-3p和EIF4E3相互作用。此外,miR-148b-3p敲低对HCCLM3细胞的影响与LINC01554过表达相似,且miR-148b-3p mimics可逆转LINC01554过表达诱导的细胞活力、凋亡、迁移和侵袭的变化。结论:LINC01554过表达可通过miR-148b-3p/EIF4E3抑制HCCLM3细胞的生长和转移。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
LINC01554在肝癌中是否通过ceRNA机制调控肝癌细胞的恶性表型?
核心机制
LINC01554作为ceRNA海绵吸附miR-148b-3p,上调EIF4E3表达,进而抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进凋亡。
主要证据
HCCLM3细胞过表达LINC01554抑制活力、迁移和侵袭并促进凋亡;miR-148b-3p敲低表型相似;miR-148b-3p mimics逆转LINC01554过表达效应;双荧光素酶报告基因验证相互作用。
研究意义
为LINC01554/miR-148b-3p/EIF4E3轴作为肝癌治疗的新靶点和通路提供依据。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

筛选目标lncRNA

鉴定与肝癌相关的、具有研究空白的关键lncRNA。

基于前期差异表达lncRNAs,随机选取5个下调的lncRNAs进行RT-qPCR验证,结合文献检索最终选定LINC01554;并在临床样本中验证其表达。

2

构建LINC01554过表达并检测细胞功能

验证LINC01554过表达对肝癌细胞活力、凋亡、迁移和侵袭的影响。

用pCDH-LINC01554转染HCCLM3细胞,RT-qPCR验证过表达效率,然后进行CCK-8、流式细胞术、Transwell实验检测细胞功能,并用RT-qPCR和Western blot检测相关基因/蛋白表达。

3

鉴定LINC01554的靶miRNA和mRNA

预测并验证LINC01554相互作用的miRNA和mRNA。

用starbase预测靶miRNAs(miR-148b-3p等)和靶mRNAs(EIF4E3等),RT-qPCR验证表达,双荧光素酶报告基因实验验证结合关系。

4

验证miR-148b-3p敲低的功能效应

验证miR-148b-3p敲低对HCCLM3细胞功能及基因表达的影响。

用miR-148b-3p inhibitor转染HCCLM3细胞,检测细胞活力、凋亡、迁移、侵袭及相关基因/蛋白表达。

5

回复实验验证LINC01554通过miR-148b-3p/EIF4E3发挥作用

验证miR-148b-3p mimics是否能逆转LINC01554过表达引起的效应。

共转染pCDH-LINC01554和miR-148b-3p mimics,检测细胞功能及基因/蛋白表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基Gibco11995500BT
DMEM/F12培养基--C11330500BT
MEM培养基Gibco41500034
胎牛血清Gibco10099-141
青霉素/链霉素Gibco15140-122
RNAiso Plus试剂Takara9109
PrimeScript™ II 第一链cDNA合成试剂盒Takara6210A
Lipofectamine 3000转染试剂Thermo Fisher ScientificL3000015
双荧光素酶报告基因检测系统PromegaE1910
CCK-8试剂盒Beyotime BiotechnologyC0038
Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒Beyotime BiotechnologyC1062M
RIPA裂解液Beyotime BiotechnologyP0013B
BCA蛋白定量试剂盒Boster BioengineeringAR0146
抗caspase3抗体Proteintech19677-1-AP
抗E-cadherin抗体Proteintech20874-1-AP
抗TIMP3抗体Proteintech10858-1-AP
抗GAPDH抗体Proteintech60004-1-AP
山羊抗兔IgG-HRP二抗Jackson ImmunoResearch111-035-003
Transwell小室(8 μm)Guangzhou Jet Bio-FiltrationTCS013024
基质胶BD356234
结晶紫Beyotime BiotechnologyC0121
荧光显微镜IX70Olympus--
ECL化学发光检测系统T4600Shanghai Tianneng Technology--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养与转染
细胞系来源、培养基和血清浓度;转染试剂和转染量(pCDH-LINC01554 3μg,miR-148b-3p inhibitor 100nM,miR-148b-3p mimics 20pM)
阅读提示:Materials and methods: Cell culture and patient collection, Cell transfection
RT-qPCR
引物序列、内参基因(U6, GAPDH)、循环条件
阅读提示:Materials and methods: Real-time quantitative PCR (RT-qPCR), Table 1
双荧光素酶报告基因实验
psiCHECK-LINC01554-WT/MUT和pGL3-EIF4E3-WT/MUT质粒构建,共转染比例(0.3μg),miR-148b-3p mimics浓度(100nM)
阅读提示:Materials and methods: Dual-luciferase reporter gene assay, Results section 3.3
细胞功能实验
CCK-8检测时间点(24h,48h,72h)和细胞密度(1×10^4);流式凋亡检测试剂盒和使用方法;Transwell细胞密度(5×10^5)和培养时间(48h)
阅读提示:Materials and methods: Cell viability and apoptosis, Cell migration and invasion, Results section 3.2
Western blot
抗体稀释比(anti-caspase3 1:1000, anti-E-cadherin 1:2000, anti-TIMP3 1:1000, anti-GAPDH 1:10000),二抗稀释比(1:5000)
阅读提示:Materials and methods: Western blot