筛选目标lncRNA
鉴定与肝癌相关的、具有研究空白的关键lncRNA。
基于前期差异表达lncRNAs,随机选取5个下调的lncRNAs进行RT-qPCR验证,结合文献检索最终选定LINC01554;并在临床样本中验证其表达。
Long non-coding RNA LINC01554 overexpression suppresses viability, migration, and invasion of liver cancer cells through regulating miR-148b-3p/EIF4E3.
包含细胞模型(HCCLM3等)功能实验、双荧光素酶报告基因、临床组织样本验证及过表达/敲低和回复实验,多个独立证据层级。
HCCLM3细胞 HepG2细胞 PLC/PRF/5细胞 临床肝癌组织样本
LINC01554在肝癌细胞系中低表达,需验证过表达效率(约4000倍) miR-148b-3p mimics和inhibitor的浓度(20pM,100nM)及转染时间(6h后换液,48h检测) 双荧光素酶报告基因实验验证LINC01554-miR-148b-3p和miR-148b-3p-EIF4E3相互作用 细胞功能实验(CCK-8、流式、Transwell)的检测时间点(24h,48h,72h)和细胞密度(1×104,5×105)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定与肝癌相关的、具有研究空白的关键lncRNA。
基于前期差异表达lncRNAs,随机选取5个下调的lncRNAs进行RT-qPCR验证,结合文献检索最终选定LINC01554;并在临床样本中验证其表达。
验证LINC01554过表达对肝癌细胞活力、凋亡、迁移和侵袭的影响。
用pCDH-LINC01554转染HCCLM3细胞,RT-qPCR验证过表达效率,然后进行CCK-8、流式细胞术、Transwell实验检测细胞功能,并用RT-qPCR和Western blot检测相关基因/蛋白表达。
预测并验证LINC01554相互作用的miRNA和mRNA。
用starbase预测靶miRNAs(miR-148b-3p等)和靶mRNAs(EIF4E3等),RT-qPCR验证表达,双荧光素酶报告基因实验验证结合关系。
验证miR-148b-3p敲低对HCCLM3细胞功能及基因表达的影响。
用miR-148b-3p inhibitor转染HCCLM3细胞,检测细胞活力、凋亡、迁移、侵袭及相关基因/蛋白表达。
验证miR-148b-3p mimics是否能逆转LINC01554过表达引起的效应。
共转染pCDH-LINC01554和miR-148b-3p mimics,检测细胞功能及基因/蛋白表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11995500BT |
| DMEM/F12培养基 | -- | C11330500BT | |
| MEM培养基 | Gibco | 41500034 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| RNA提取 | RNAiso Plus试剂 | Takara | 9109 |
| RT-qPCR | PrimeScript™ II 第一链cDNA合成试剂盒 | Takara | 6210A |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0038 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C1062M |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Boster Bioengineering | AR0146 | |
| 抗caspase3抗体 | Proteintech | 19677-1-AP | |
| 抗E-cadherin抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| 抗TIMP3抗体 | Proteintech | 10858-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-AP | |
| 山羊抗兔IgG-HRP二抗 | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| 细胞迁移和侵袭 | Transwell小室(8 μm) | Guangzhou Jet Bio-Filtration | TCS013024 |
| 基质胶 | BD | 356234 | |
| 细胞染色 | 结晶紫 | Beyotime Biotechnology | C0121 |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜IX70 | Olympus | -- |
| Western blot | ECL化学发光检测系统T4600 | Shanghai Tianneng Technology | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源、培养基和血清浓度;转染试剂和转染量(pCDH-LINC01554 3μg,miR-148b-3p inhibitor 100nM,miR-148b-3p mimics 20pM) 阅读提示:Materials and methods: Cell culture and patient collection, Cell transfection |
| RT-qPCR | 引物序列、内参基因(U6, GAPDH)、循环条件 阅读提示:Materials and methods: Real-time quantitative PCR (RT-qPCR), Table 1 |
| 双荧光素酶报告基因实验 | psiCHECK-LINC01554-WT/MUT和pGL3-EIF4E3-WT/MUT质粒构建,共转染比例(0.3μg),miR-148b-3p mimics浓度(100nM) 阅读提示:Materials and methods: Dual-luciferase reporter gene assay, Results section 3.3 |
| 细胞功能实验 | CCK-8检测时间点(24h,48h,72h)和细胞密度(1×10^4);流式凋亡检测试剂盒和使用方法;Transwell细胞密度(5×10^5)和培养时间(48h) 阅读提示:Materials and methods: Cell viability and apoptosis, Cell migration and invasion, Results section 3.2 |
| Western blot | 抗体稀释比(anti-caspase3 1:1000, anti-E-cadherin 1:2000, anti-TIMP3 1:1000, anti-GAPDH 1:10000),二抗稀释比(1:5000) 阅读提示:Materials and methods: Western blot |