甲状腺乳头状癌中免疫原性细胞死亡相关长链非编码RNA的预后价值及潜在免疫机制

The Prognostic Value and Potential Immune Mechanisms of lncRNAs Related to Immunogenic Cell Death in Papillary Thyroid Carcinoma.

作者信息Yixian Wang, Xin Li, Yinde Huang, Qingwei Gang, Mingyu Liu, Han Zhang, Shikai Shen, Yao Qi, Jian Zhang
PMID38566983
发布时间2024-03-29
DOI10.2147/JIR.S456452

实验完整度

包含生物信息学分析和体外细胞实验,但缺少体内动物模型和机制深入研究,验证层级有限。

主要模型

BCPAP细胞系 TPC1细胞系 TCGA-THCA队列 GSE33630数据集

重点核对

LINC00924过表达质粒转染BCPAP和TPC1细胞 EdU实验检测细胞增殖 Transwell实验检测细胞侵袭 划痕实验检测细胞迁移 流式细胞术检测细胞凋亡

摘要

背景:与免疫原性细胞死亡(ICD)相关的长链非编码RNA(lncRNAs)在肿瘤发生中发挥关键作用,并为甲状腺乳头状癌(PTC)患者提供预后见解。本研究探讨ICD相关lncRNAs对PTC预后的影响。方法:从癌症基因组图谱-甲状腺癌数据库(TCGA-THCA)获取PTC样本,并进行共识聚类分析以阐明ICD相关lncRNA表达的影响。为了评估这些lncRNAs的预后意义,我们建立了一个预后模型。此外,我们进行了GO和KEGG富集分析,使用CIBERSORT和ssGSEA评估免疫细胞浸润(ICI),检查了免疫检查点表达、肿瘤突变负荷(TMB)、肿瘤微环境(TME)、T细胞功能障碍和排斥(TIDE)、TCIA以及不同组间的药物敏感性。进行了一系列综合的体外实验,包括EdU标记、伤口划痕实验、Transwell实验和流式细胞术,以阐明LINC00924在转染了LINC00924过表达质粒的两种PTC细胞系BCPAP和TPC1中的调控作用。结果:两个不同的聚类表现出不同的TME、BRAF、NRAS和ICI特征,提示PTC中潜在的免疫机制。我们的预后模型确定了七个lncRNAs:SRRM2-AS1、AC008556.1、BHLHE40-AS1、EGOT、AL39066.1、LINC00924和PICART1。ICD相关lncRNAs的表达与PTC患者的无进展间隔(PFI)相关。LINC00924的过表达显著降低了PTC细胞的增殖、迁移和侵袭,同时增加了凋亡。结论:我们的研究结果强调了ICD相关lncRNAs作为PTC中PFI预后生物标志物的潜力。体外实验提示LINC00924在PTC进展中的保护作用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
ICD相关lncRNAs对PTC患者预后有何影响,其潜在免疫机制是什么?
核心机制
ICD相关lncRNAs可能通过增强肿瘤细胞免疫原性,改变肿瘤微环境中免疫细胞组成(如减少Tregs、增加M1巨噬细胞和Tfh),从而改善患者预后。
主要证据
基于TCGA-THCA队列的共识聚类和预后模型分析,以及体外实验显示LINC00924过表达抑制PTC细胞增殖、迁移和侵袭并促进凋亡。
研究意义
ICD相关lncRNAs有望作为PTC患者预后的生物标志物,为临床治疗提供新靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

数据获取与处理

获取PTC转录组和临床数据,为后续分析奠定基础。

从TCGA-THCA获取512个PTC样本和58个正常甲状腺组织的转录组和单核苷酸变异数据,临床数据从UCSC Xena浏览器获取;从GEO获取GSE33630数据集(49个PTC样本和45个癌旁样本)。

2

ICD相关lncRNA鉴定与共识聚类

鉴定与ICD相关的lncRNAs并基于其表达对PTC样本进行亚型分类。

通过文献综述获取34个ICD基因,利用limma包进行共表达分析(|相关系数|≥0.5,p<0.001),获得329个lncRNAs;通过单变量Cox分析筛选13个调控因子;使用ConsensusClusterPlus进行共识聚类,将TCGA-THCA队列分为两个亚型(C1和C2)。

3

亚型间差异分析

比较两个亚型在功能富集、突变、免疫浸润等方面的差异。

进行GO和KEGG富集分析、TMB分析、免疫细胞浸润分析、HLA和免疫检查点基因表达分析。

4

预后模型构建与验证

构建基于ICD相关lncRNAs的预后模型并验证其预测PTC患者PFI的能力。

通过差异表达分析(P<0.05和|fold change|>1)和LASSO回归结合多变量Cox分析构建预后模型,包含7个lncRNAs。根据风险评分将患者分为高低风险组,并进行K-M生存分析、ROC曲线分析、临床亚组分析、列线图构建等验证。

5

体外验证LINC00924功能

验证LINC00924在PTC细胞系中的功能作用。

在BCPAP和TPC1细胞中转染LINC00924过表达质粒,通过qRT-PCR验证过表达效率,然后进行EdU实验、划痕实验、Transwell实验和流式细胞术检测细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
1640培养基----
胎牛血清----
Lipo3000转染试剂InvitrogenL3000015
SevenFast总RNA提取试剂盒--SM132
Takara ExTaq PCR试剂盒Takara639505
EdU试剂盒ApexBioK1075
细胞凋亡检测试剂盒MultiSciencesAT105
FACS C6流式细胞仪----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养与转染
BCPAP和TPC1细胞系来源;培养条件(1640培养基+10%FBS);转染试剂Lipo3000;LINC00924过表达质粒;细胞融合度约70%。
阅读提示:Materials and Methods: Cell Transfection
EdU实验
细胞接种密度3×10^4 cells/well;EdU浓度10μM;孵育时间5小时;固定和透化时间;Click反应时间;Hoechst染色时间。
阅读提示:Materials and Methods: EdU Assay
划痕实验
细胞培养至完全融合;划痕后0和24小时观察;ImageJ计算伤口闭合面积。
阅读提示:Materials and Methods: Wound Scratch Assay
Transwell实验
基质胶稀释倍数(10倍);细胞浓度90,000 cells/mL;上室300μL细胞悬液;下室含10%FBS培养基;孵育24小时;结晶紫染色。
阅读提示:Materials and Methods: Transwell Assay
细胞凋亡检测
Annexin V-APC 5μL和7-AAD 10μL;孵育条件(室温黑暗5分钟);流式细胞仪型号。
阅读提示:Materials and Methods: Cell Apoptosis Analysis