HucMSC-EVs的分离与鉴定
验证从HucMSC培养上清中分离的细胞外囊泡的形态、大小和标志物。
通过超速离心从HucMSC培养上清中分离EVs，使用透射电镜观察形态，NTA检测粒径分布，Western blot检测EVs标志物（CD9、TSG101）和阴性标志物（Calnexin），并通过PKH67标记验证HK-2细胞摄取。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
人脐带间充质干细胞通过分泌携带miR-148b-3p的细胞外囊泡靶向丙酮酸脱氢酶激酶4抑制再灌注阶段的内质网应激，从而保护肾脏免受缺血再灌注损伤
Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Protect against Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Secreting Extracellular Vesicles Loaded with miR-148b-3p That Target Pyruvate Dehydrogenase Kinase 4 to Inhibit Endoplasmic Reticulum Stress at the Reperfusion Stages.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HK-2细胞OGD模型）、体内小鼠肾I/R模型、双荧光素酶报告基因、Western blot、流式细胞术、qRT-PCR等，并进行了EVs表征和功能验证。
主要模型
HK-2人肾小管上皮细胞系 C57BL/6小鼠肾缺血再灌注模型
重点核对
HK-2细胞缺氧/复氧（OGD）处理：缺氧溶液含antimycin A（5 mM）和2-脱氧-D-葡萄糖（5 mM），处理45分钟 HucMSC-EVs浓度：体内注射5 × 10^10颗粒/100 μL 小鼠肾I/R模型：C57BL/6雄性小鼠，8-10周龄，20-25 g；夹闭肾动脉静脉45分钟 HucMSC-EVs处理时间：再灌注阶段给药，小鼠在I/R前1小时尾静脉注射 细胞凋亡检测：Annexin V-FITC和PI染色，流式细胞术
摘要
肾缺血再灌注（I/R）损伤是急性肾损伤（AKI）的主要原因，死亡率高。最近的研究报道，人脐带间充质干细胞（HucMSCs）因其独特的特性在修复器官和组织损伤中发挥重要作用。然而，HucMSC细胞外囊泡（HucMSC-EVs）促进肾小管细胞修复的潜力仍有待探索。本研究发现，来源于HucMSCs的HucMSC-EVs发挥保护作用，并与肾I/R损伤相关。我们发现HucMSC-EVs中的miR-148b-3p对肾I/R损伤具有保护作用。过表达miR-148b-3p的HK-2细胞通过抑制凋亡免受I/R损伤。接下来，在线预测miR-148b-3p的靶mRNA，并通过双荧光素酶鉴定和验证靶mRNA丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）。我们发现I/R损伤显著增加内质网（ER）应激，而siR-PDK4抑制这些效应并保护免受I/R损伤。有趣的是，将HucMSC-EVs给予HK-2细胞后，I/R损伤诱导的PDK4表达和ER应激被显著抑制。HK-2摄取来自HucMSC-EVs的miR-148b-3p，其由I/R损伤诱导的ER应激被显著解除调控。本研究表明，HucMSC-EVs在早期I/R阶段保护肾脏免受I/R损伤。这些结果为HucMSC-EVs治疗AKI提供了一种新机制，并为I/R损伤提供了新的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡（HucMSC-EVs）是否通过递送miR-148b-3p靶向PDK4抑制内质网应激，从而保护肾脏免受缺血再灌注损伤？
- 核心机制
- HucMSC-EVs通过递送miR-148b-3p至肾小管上皮细胞，直接靶向并抑制PDK4表达，进而抑制ATF-6通路介导的内质网应激，减少细胞凋亡，从而减轻肾I/R损伤。
- 主要证据
- 体外实验显示，HucMSC-EVs可被HK-2细胞摄取，miR-148b-3p在EVs中富集，过表达miR-148b-3p抑制I/R诱导的凋亡，双荧光素酶验证PDK4为直接靶点；体内实验中，尾静脉注射HucMSC-EVs降低血清肌酐和尿素氮，改善肾组织病理损伤，并降低PDK4和cleaved caspase-3表达。
- 研究意义
- 本研究首次揭示HucMSC-EVs通过miR-148b-3p/PDK4/ATF-6通路保护肾I/R损伤的机制，为AKI的临床治疗提供了潜在的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HucMSC-EVs对HK-2细胞I/R损伤的保护作用
验证HucMSC-EVs能否抑制I/R诱导的HK-2细胞凋亡。
建立HK-2细胞氧糖剥夺/复氧模型，分为对照组、I/R组、I/R+HucMSCs共培养组、I/R+HucMSC-EVs组、I/R+无EVs条件培养基组；通过流式细胞术检测凋亡率，Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3。
miR-148b-3p的表达及功能验证
验证HucMSC-EVs中miR-148b-3p的富集及其对I/R损伤的保护作用。
通过qPCR检测HucMSC-EVs和HK-2细胞中miR-148b-3p水平，以及在I/R不同时间点的变化；在HK-2细胞中转染miR-148b-3p mimics和inhibitor，检测其对凋亡及凋亡相关蛋白的影响。
miR-148b-3p靶基因预测与验证
预测并验证miR-148b-3p的直接靶基因。
使用PITA、PicTar、TargetScan和miRanda预测靶基因，并筛选与凋亡相关的候选基因；通过qPCR检测mRNA水平变化，双荧光素酶报告实验验证miR-148b-3p与PDK4 3'UTR的结合。
验证PDK4在ER应激中的作用
验证PDK4是否通过ATF-6通路介导ER应激并加重I/R损伤。
在HK-2细胞中敲低PDK4（siR-PDK4），进行I/R处理，通过Western blot检测ER应激相关蛋白（ATF-6、GRP78/BIP、CHOP）的表达。
HucMSC-EVs对ER应激的影响
验证HucMSC-EVs处理是否抑制I/R诱导的ER应激。
HK-2细胞I/R后分别用无EVs条件培养基、HucMSCs共培养、HucMSC-EVs处理，通过Western blot检测ATF-6、GRP78/BIP、CHOP表达。
体内验证HucMSC-EVs对肾I/R损伤的保护作用
评估HucMSC-EVs在体内对肾I/R损伤的保护效果。
建立小鼠肾I/R模型，通过尾静脉注射HucMSC-EVs或PBS，检测肾功能指标（BUN、CREA）、肾组织病理（HE染色）和PDK4、cleaved caspase-3的表达（免疫组化）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | F12培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Millipore Sigma | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 2-脱氧-D-葡萄糖 | Sigma Aldrich | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EVs标记 | PKH26 | Millipore Sigma | -- |
| PKH67 | Millipore Sigma | -- | |
| qRT-PCR | RNA提取试剂盒 | Takara | -- |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒 | Takara | -- | |
| ABI 7500序列检测系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | pmirGLO载体 | Promega | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore Sigma | -- | |
| 抗cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664S | |
| 抗Bcl-2抗体 | Cell Signaling Technology | 3498 | |
| 抗GRP78抗体 | Cell Signaling Technology | 3177 | |
| 抗IRE1-α抗体 | Cell Signaling Technology | 3294 | |
| 抗XBP-1S抗体 | Cell Signaling Technology | 83418 | |
| 抗CHOP抗体 | Cell Signaling Technology | 2895 | |
| 抗p-PERK抗体 | Cell Signaling Technology | 3179 | |
| 抗ATF6抗体 | Cell Signaling Technology | 65880 | |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 抗PDK4抗体 | ImmunoWay Biotechnology Company | YN5701 | |
| 抗TSG101抗体 | Proteintech Group, Inc. | 28283-1-AP | |
| 抗CD9抗体 | Proteintech Group, Inc. | 20597-1-AP |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EVs分离与鉴定 | 超速离心步骤和条件；EVs标志物（CD9、TSG101）和阴性标志物（Calnexin）的表达；EVs平均粒径 阅读提示：Methods：4.10. Small Extracellular Vesicles Isolation; 4.11. Small Extracellular Vesicles Identification; Figure 1 |
| 细胞培养与OGD模型 | HK-2细胞培养条件（F12培养基，10% FBS，37°C，5% CO2）；OGD处理时间（45分钟）及试剂浓度（antimycin A 5 mM，2-脱氧-D-葡萄糖 5 mM） 阅读提示：Methods：4.2. Cell Culture Experiments |
| 细胞转染 | 转染试剂（Lipofectamine 2000）；转染浓度及时间；miRNA mimics/inhibitor/siRNA序列 阅读提示：Methods：4.3. Cell Transfection |
| 双荧光素酶报告基因 | 载体构建（pmirGLO-PDK4-WT/MUT）；293T细胞转染；检测时间（48小时） 阅读提示：Methods：4.6. Dual-Luciferase Reporter Assay |
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、体重；缺血时间（45分钟）；再灌注时间（24小时）；EVs剂量（5 × 10^10颗粒/100 μL）及给药时间（再灌注前1小时） 阅读提示：Methods：4.4. Animal Experiments |
| 凋亡检测 | 流式细胞术的染色步骤（Annexin V-FITC和PI）；Western blot检测凋亡蛋白（Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3） 阅读提示：Methods：4.15. Flow Cytometric Analysis; 4.16. Western Blotting |