鉴定NDC80为ccRCC预后基因
通过整合多个数据集的转录组数据，鉴定在ccRCC中表达上调并预测预后的关键基因。
对4个GEO队列（182例ccRCC和127例正常肾组织）进行差异表达分析，获得743个共同差异基因，构建PPI网络，通过MCC方法鉴定hub基因，并评估其预后价值。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
NDC80状态确定有丝分裂激酶抑制剂作为透明细胞肾细胞癌的新兴治疗选择
NDC80 status pinpoints mitotic kinase inhibitors as emerging therapeutic options in clear cell renal cell carcinoma.
实验完整度
高包含生物信息学分析、体外细胞功能实验（增殖、迁移、侵袭、细胞周期、代谢）、免疫组化、异种移植小鼠实验等多层级验证，且包含功能验证和机制验证。
主要模型
786-O细胞系 Caki-1细胞系 HK2正常肾上皮细胞 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
NDC80 mRNA表达水平在TCGA和ICGC配对样本中的差异（p=1.4e-14和p=1.2e-11） NDC80蛋白在15对ccRCC及正常组织中的免疫组化评分（p<0.0001） siRNA敲低NDC80后细胞周期S期阻滞和代谢变化（OCR、ECAR） 药物处理浓度：tozasertib、ZM447439、BI-2536的IC50值 体内实验：BALB/c裸鼠皮下注射2x10^7细胞，75 mg/kg tozasertib i.p.每48小时给药，持续2周
摘要
大约30%的透明细胞肾细胞癌（ccRCC）患者在诊断时已发生转移，导致5年生存率仅为13%。尽管抗PD-1免疫治疗改善了生存，但仍然强烈需要新的治疗选择。通过整合网络分析，我们确定了有丝分裂调节因子NDC80作为ccRCC进展的预测因子。NDC80的过表达通过促进细胞周期S期进展以及增强糖酵解和线粒体呼吸来促进恶性表型。尽管有高水平的免疫浸润，特别是来自肿瘤驻留的具有耗竭表型的CD8+T细胞，NDC80定义了一类对免疫检查点阻断反应不良的ccRCC。相反，生物信息学确定NDC80高表达的ccRCC对有丝分裂激酶PLK1和AURK的抑制剂敏感，我们在细胞系和小鼠异种移植研究中验证了这些治疗方法。因此，NDC80状态指出了有丝分裂激酶抑制剂作为难以治疗的ccRCC的有希望的治疗选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NDC80是否可作为透明细胞肾细胞癌的预后标志物和治疗反应预测因子？
- 核心机制
- NDC80通过促进细胞周期S期进展和增强糖酵解及线粒体呼吸驱动ccRCC恶性表型；高NDC80与免疫耗竭和免疫治疗不良相关，但对有丝分裂激酶抑制剂（AURK和PLK1）敏感。
- 主要证据
- 基于GEO和TCGA数据集的整合网络分析鉴定NDC80为hub基因；体外敲低和过表达实验显示NDC80促进增殖、迁移、侵袭、代谢；免疫浸润分析显示NDC80与耗竭CD8+T细胞相关；GDSC药物敏感性分析和异种移植实验验证了AURK/PLK1抑制剂敏感性。
- 研究意义
- NDC80可作为首个基于功能的生物标志物，用于预测ccRCC对有丝分裂激酶抑制剂的反应，为难以治疗的ccRCC提供新的治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证NDC80在ccRCC中的过表达
在mRNA和蛋白水平验证NDC80在ccRCC中的高表达。
通过TCGA和ICGC配对样本分析NDC80 mRNA表达，并用免疫组化检测15对肿瘤和正常组织中蛋白表达，免疫印迹检测细胞系中蛋白水平。
体外功能研究NDC80对恶性表型的影响
评估NDC80对ccRCC细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期的影响。
在786-O和Caki-1细胞中敲低NDC80（siRNA1和siRNA2），通过CCK8、划痕实验、Transwell和流式细胞术检测功能变化；并在HK2细胞中过表达NDC80，观察功能获得效果。
评估NDC80对细胞代谢的影响
验证NDC80是否影响糖酵解和线粒体呼吸。
使用Agilent Seahorse XFe96分析仪测量NDC80敲低或过表达后的OCR和ECAR。
分析NDC80与免疫浸润和免疫治疗反应的关系
确定NDC80表达是否与免疫细胞浸润、免疫治疗反应相关。
使用ESTIMATE、TIMER、CIBERSORT和TIDE算法分析TCGA数据，并结合单细胞RNA-seq数据分析T细胞亚群和耗竭标志物。
药物敏感性分析和体外验证
从GDSC数据库中寻找与NDC80表达负相关的药物，并验证其对ccRCC细胞的作用。
分析GDSC2数据库中化合物IC50与NDC80表达的相关性，筛选出AURK和PLK1抑制剂；在ccRCC细胞系中评估这些抑制剂的剂量反应。
体内验证AURK抑制剂疗效
评估tozasertib在ccRCC异种移植模型中的抗肿瘤活性。
在BALB/c裸鼠皮下注射786-O或Caki-1细胞形成肿瘤，腹腔注射tozasertib或溶剂，测量肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证代谢功能变化
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组化 | 抗NDC80抗体 | Proteintech | 18932-1-AP |
| 蛋白质印迹 | 抗β-肌动蛋白抗体 | ABclonal | AC006 |
| HRP山羊抗兔IgG（H+L） | ABclonal | AS014 | |
| 细胞增殖实验 | CCK-8试剂盒 | Absin | Abs50003 |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | 81845 |
| 核糖核酸酶A | Solarbio | R1030 | |
| 动物实验 | 基质胶 | BD Biosciences | 356234 |
| Transwell侵袭实验 | 结晶紫 | Sigma-Aldrich | C0775 |
| 药物处理 | 陶扎色替 | MedChemExpress | HY-10161 |
| BI-2536 | MedChemExpress | HY-50698 | |
| ZM447439 | MedChemExpress | HY-10128 | |
| 代谢分析 | 寡霉素 | MedChemExpress | HY-N6782 |
| FCCP | MedChemExpress | HY-100410 | |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | 45656 | |
| 2-脱氧葡萄糖 | Sigma-Aldrich | D8375 | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 蛋白质印迹 | 蛋白酶抑制剂混合物 | ThermoFisher | 78438 |
| 细胞培养 | HK2细胞系 | National Collection of Authenticated Cell cultures | SCSP-511 |
| 786-O细胞系 | National Collection of Authenticated Cell cultures | TCHu186 | |
| 769-P细胞系 | National Collection of Authenticated Cell cultures | TCHu215 | |
| Caki-1细胞系 | National Collection of Authenticated Cell cultures | SCSP-5064 | |
| 载体构建 | pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro质粒 | Tsingke | -- |
| pCDH-CMV-NDC80-EF1-copGFP-T2A-Puro质粒 | This paper | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件：786-O、769-P用RPMI-1640，Caki-1用Myco-5A，HK2用MEM，均含10% FBS和1%抗生素，在37°C、5% CO2下培养 阅读提示：见STAR★Methods中的Cell lines部分 |
| 基因敲低和过表达 | siRNA序列和转染条件：siRNA1 (GCAGCCUUAGUUUGGCUAATT)、siRNA2 (GGAGGAUACUUUAGAACAATT)和对照siRNA，转染使用Lipofectamine 2000，转染后48小时进行功能实验 阅读提示：见STAR★Methods中的DNA and RNA transfection部分 |
| 细胞增殖实验 | CCK8实验条件：细胞密度2000个/孔，96孔板，检测时间0、24、48、72小时，孵育1小时后测450nm吸光度 阅读提示：见STAR★Methods中的Cell proliferation and cell cytotoxicity (CCK8) assay部分 |
| 细胞周期分析 | 细胞周期分析条件：siRNA转染72小时后，PI染色，流式细胞术检测细胞周期分布 阅读提示：见STAR★Methods中的Cell cycle analysis部分 |
| 代谢测量 | Seahorse XFe96条件：细胞密度20000个/孔，OCR和ECAR测量时使用的药物浓度（oligomycin 1 μM, FCCP 0.5 μM, rotenone/antimycin A 1 μM, glucose 10 mM, 2-DG 50 mM） 阅读提示：见STAR★Methods中的Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR)部分 |
| 体内实验 | 异种移植模型条件：2x10^7细胞与Matrigel混合皮下注射，5只/组，75 mg/kg tozasertib i.p.每48小时给药，持续2周 阅读提示：见STAR★Methods中的In vivo mouse experiments部分 |