体外抗增殖活性评估
评估LBH589对STS细胞系增殖和集落形成能力的影响。
用不同浓度LBH589处理HT1080、SK-LMS-1、SW872和U2197细胞，进行MTT实验和集落形成实验。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
帕比司他增强软组织肉瘤中NK细胞的细胞毒性
Panobinostat enhances NK cell cytotoxicity in soft tissue sarcoma.
实验完整度
高包含体外细胞增殖与集落形成实验、转录组分析、流式检测、Western blot、ChIP-qPCR、体外共培养杀伤实验及小鼠体内移植瘤模型等多个证据层级。
主要模型
HT1080纤维肉瘤细胞系 SK-LMS-1平滑肌肉瘤细胞系 NOD/SCID小鼠HT1080移植瘤模型 NK-92细胞系和原代NK细胞
重点核对
LBH589处理浓度（0-20 nM）和时间（0-5天） NK细胞与靶细胞效靶比（12:1, 6:1, 3:1） Wnt/β-catenin抑制剂ICG001浓度（5 μM） 体内实验中LBH589给药剂量（10 mg/kg，每周一次）和NK-92细胞数量（5×10^6） NK细胞来源（NK-92细胞系及健康供者PBMCs分离的原代NK细胞）
摘要
肉瘤是一种罕见且异质性强的间充质恶性肿瘤，预后较差。帕比司他（LBH589）作为组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂之一，已在肉瘤患者中显示出抗肿瘤活性，但其机制仍不清楚。本研究发现，单独使用LBH589可抑制软组织肉瘤（STS）细胞系的增殖和集落形成。转录组分析显示，LBH589处理增强了NK细胞介导的细胞毒性。实时定量PCR和流式细胞术（FACS）进一步证实，LBH589增加了NKG2D配体MICA/MICB的表达。机制上，LBH589通过上调β-catenin启动子中的组蛋白乙酰化来激活Wnt/β-catenin通路。体外共培养实验和体内动物实验表明，LBH589增加了自然杀伤（NK）细胞的细胞毒性，而Wnt/β-catenin抑制剂则降低了这种效应。我们的发现表明，LBH589促进NK细胞的抗肿瘤作用，凸显了LBH589作为NK细胞免疫治疗的有效辅助药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LBH589是否以及如何通过调节NK细胞介导的细胞毒性来抑制软组织肉瘤？
- 核心机制
- LBH589通过上调β-catenin启动子区域的组蛋白乙酰化激活Wnt/β-catenin通路，进而上调NKG2D配体MICA/MICB的表达，增强NK细胞对肉瘤细胞的杀伤活性。
- 主要证据
- 体外实验显示LBH589抑制STS细胞增殖并上调MICA/MICB表达；ChIP-qPCR显示β-catenin启动子H3K27ac富集；共培养实验证实LBH589增强NK细胞杀伤，且Wnt抑制剂ICG001逆转此效应；体内移植瘤模型显示LBH589联合NK-92细胞显著抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- LBH589有望作为NK细胞免疫治疗的辅助药物，为软组织肉瘤的治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析揭示NK细胞毒性通路
探索LBH589处理对STS细胞转录组的影响，寻找与免疫相关的信号通路。
LBH589或DMSO处理HT1080和SK-LMS-1细胞48小时，提取RNA进行RNA-seq，并通过GSEA和KEGG富集分析。
验证NKG2D配体表达上调
验证LBH589对MICA/MICB及ULBP等NKG2D配体表达的影响。
qRT-PCR检测mRNA表达，流式细胞术检测细胞表面MICA/MICB蛋白水平。
机制探究：Wnt/β-catenin通路激活
探究LBH589上调MICA/MICB的分子机制，特别是信号通路的变化。
Western blot检测PI3K/AKT、MAPK/ERK、JAK/STAT3和Wnt/β-catenin通路蛋白表达；使用通路抑制剂处理细胞，流式检测MICA/MICB水平；ChIP-qPCR检测β-catenin启动子组蛋白乙酰化。
体外NK细胞杀伤实验
评估LBH589处理的肉瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性，并验证Wnt通路的作用。
将LBH589或LBH589+ICG001预处理的靶细胞与NK-92或原代NK细胞共培养，通过LDH释放法检测细胞毒性。
体内联合治疗效果验证
在体内模型中验证LBH589联合NK-92细胞对肿瘤生长的抑制作用及MICA/MICB表达变化。
NOD/SCID小鼠皮下接种HT1080-LUC细胞，随机分为四组（PBS、LBH589、NK-92、联合），监测肿瘤生长并通过生物发光成像和免疫组化分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| MEM α培养基 | procell | PM150421 | |
| β-巯基乙醇 | procell | PB180633 | |
| 马血清 | procell | 164215-100 | |
| 胎牛血清 | procell | 164210-500 | |
| 青霉素-链霉素 | procell | PB180120 | |
| 重组人白细胞介素-2 | -- | -- | |
| 细胞增殖检测 | MTT试剂 | BD Biosciences | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 分光光度酶标仪 | BioTek ELX 800 | -- | |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | -- | -- |
| NK细胞分离 | Ficoll分离液 | -- | -- |
| NK细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-092-657 | |
| NK细胞活化 | 重组人白细胞介素-15 | PeproTech | 200-15-10 |
| 重组人白细胞介素-2 | PeproTech | 200-02-50 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL化学发光检测系统 | Thermo Fisher Scientific | 34095 | |
| 成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot (antibody) | 抗MICA/MICB抗体 | Biolegend | 320906 |
| Western blot & IHC | 抗MICA/MICB抗体 | Abcam | ab224702 |
| Western blot (antibody) | 抗PI3K抗体 | CST | 4252S |
| 抗p-Akt抗体 | CST | 4060S | |
| 抗AKT抗体 | CST | 9272S | |
| 抗p-p38抗体 | CST | 4511S | |
| 抗ERK抗体 | CST | 4695S | |
| 抗p-Erk抗体 | CST | 4370S | |
| 抗JAK1抗体 | upstate | 06-665 | |
| 抗p-JAK1抗体 | upstate | 07-849 | |
| 抗Stat3抗体 | CST | 30835S | |
| 抗p-Stat3抗体 | CST | 9145S | |
| 抗β-catenin抗体 | CST | 8480s | |
| 抗vimentin抗体 | CST | 5741S | |
| 抗c-Jun抗体 | CST | 9165S | |
| 抗β-actin抗体 | CST | 3700S | |
| ChIP | 抗乙酰化组蛋白H3（Lys27）抗体 | CST | 8173S |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | -- | -- |
| Illumina HiSeq 2500测序平台 | Illumina | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| NanoDrop分光光度计 | Thermo Scientific | -- | |
| 逆转录试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| SYBR Green荧光染料 | -- | -- | |
| Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 药物处理 | 帕比司他 | -- | -- |
| ICG001 | -- | -- | |
| 鲁索替尼 | -- | -- | |
| SB203580 | -- | -- | |
| LY294002 | -- | -- | |
| 细胞毒性检测 | CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒 | -- | -- |
| ChIP | SYBR Green试剂盒 | Roche | -- |
| 动物实验 | NOD/SCID小鼠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（ATCC）、培养基（DMEM，10% FBS；MEMα，12.5%马血清，12.5%FBS，200 U/mL rhIL-2）、培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods, Cell lines |
| 体外药物处理 | LBH589浓度（0-20 nM）、处理时间（24小时至5天）、DMSO对照 阅读提示：Results, Figure 2; Materials and Methods, MTT assay, colony formation assay |
| NK细胞制备 | PBMCs分离（Ficoll密度梯度离心）、NK细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec, 130-092-657）、IL-15（50 ng/mL）和IL-2（200 U/mL）活化3天 阅读提示：Materials and Methods, Preparation of peripheral blood NK cells and activation |
| 体外杀伤实验 | 靶细胞预处理（LBH589 20 nM或ICG001 5 μM，24小时）、效靶比（12:1, 6:1, 3:1）、共培养时间4小时、LDH释放检测 阅读提示：Materials and Methods, Cytotoxicity assay; Results, Figure 5 |
| 体内实验 | 小鼠品系（NOD/SCID）、细胞接种（HT1080-LUC 皮下）、分组（PBS、LBH589、NK-92、联合）、LBH589剂量（10 mg/kg ip，每周一次）、NK-92细胞数量（5×10^6 iv）、治疗时间（第7、14、21天） 阅读提示：Materials and Methods, In Vivo Experiments; Results, Figure 6 |
| 机制验证 | ChIP实验（细胞数量5×10^6、LBH589处理24小时、抗体anti-acetyl-histone H3K27）、Western blot检测通路蛋白 阅读提示：Materials and Methods, Chromatin immunoprecipitation (Ch-IP) assays; Results, Figure 4 |