构建皮肤特异性Ufl1敲除小鼠
研究Ufl1在皮肤中的功能，通过Cre-loxP系统实现皮肤特异性敲除
将Ufl1-floxed小鼠与KRT14Cre/+小鼠杂交获得条件敲除小鼠，通过PCR、q-PCR、Western blot和免疫组化验证敲除效率和特异性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Ufl1 缺陷通过上调内皮素-1 导致皮肤色素沉着
Ufl1 deficiency causes skin pigmentation by up-regulation of Endothelin-1.
实验完整度
高包含皮肤特异性基因敲除小鼠模型、组织学与免疫组化、RNA-seq转录组分析、体外Ufmylation及蛋白质稳定性实验等多个独立验证层级。
主要模型
皮肤特异性Ufl1敲除小鼠（Ufl1f/f KRT14Cre/+） HaCaT人角质形成细胞系 HEK293T人胚肾细胞系
重点核对
Ufl1基因敲除特异性：Ufl1f/f KRT14Cre/+小鼠皮肤中Ufl1表达缺失，其他组织正常 RNA-seq差异表达分析：两个生物学重复，DESeq2，adjusted p-value<0.05 ET-1蛋白水平与mRNA水平不一致：蛋白上调而mRNA无显著变化 Ufmylation底物验证：ET-1与UFL1、DDRGK1结合，并能被UFM1修饰
摘要
Ufmylation（UFM1 修饰）是一种新发现的泛素样修饰系统，参与众多细胞过程。然而，这种修饰的调控机制和生物学功能仍大多未知。我们最近报道，Ufmylation 家族基因在人类癌症（包括黑色素瘤）中频繁发生体细胞拷贝数改变，提示 Ufmylation 参与皮肤功能和疾病。UFL1 是唯一已知的 Ufmylation E3 样连接酶。在本研究中，我们生成了皮肤特异性 Ufl1 敲除小鼠，并表明 Ufl1 的缺失导致表皮增厚、色素沉着和寿命缩短。RNA-Seq 分析表明，Ufl1 缺失导致参与黑色素生物合成的基因上调。机制上，我们发现内皮素-1（ET-1）是 Ufmylation 的新底物，这种修饰调节 ET-1 的稳定性，因此 Ufl1 的缺失上调 ET-1 的表达和分泌，进而导致黑色素生物合成基因的上调和皮肤色素沉着。我们的发现确立了 Ufl1 通过 ET-1 的 Ufmylation 修饰在皮肤色素沉着中的作用，并为皮肤疾病的治疗干预提供了机会。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Ufl1介导的Ufmylation修饰在皮肤中的生物学功能及其调控机制是什么？
- 核心机制
- Ufl1通过Ufmylation修饰ET-1，增强ET-1的稳定性；Ufl1缺失导致ET-1表达和分泌增加，进而上调黑色素生物合成基因，引起皮肤色素沉着。
- 主要证据
- 皮肤特异性Ufl1敲除小鼠表现为表皮增厚、色素沉着；RNA-seq和q-PCR显示黑色素合成基因上调；免疫荧光和western blot显示ET-1蛋白上调；Ufmylation实验证实ET-1是底物且Ufl1缺失延长其半衰期。
- 研究意义
- 揭示了Ufl1在皮肤色素沉着中的关键作用，为色素性疾病机制理解和治疗策略提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
皮肤表型分析
评估Ufl1缺失对皮肤形态、色素沉着、细胞增殖和凋亡的影响
通过HE染色观察表皮厚度；Masson-Fontana染色检测黑色素分布；Ki67和TUNEL染色分别检测增殖和凋亡；观察小鼠外观、体重和寿命。
转录组分析
鉴定Ufl1缺失引起的基因表达变化，特别是黑色素合成相关通路
对3月龄CTRL和CKO小鼠耳组织进行RNA-seq，并用q-PCR验证关键基因。
ET-1表达和分泌检测
验证Ufl1缺失是否影响ET-1的表达和分泌
通过免疫荧光和Western blot检测皮肤和HaCaT细胞中ET-1蛋白水平；ELISA检测血浆和耳组织中ET-1分泌水平。
验证ET-1作为Ufmylation底物
确定ET-1是否被Ufmylation修饰，并研究该修饰对ET-1稳定性的影响
通过免疫共沉淀和体外结合实验检测ET-1与UFL1、DDRGK1的相互作用；在HEK293T细胞中表达Ufmylation组分进行体内Ufmylation实验；用纯化的GST-ET-1进行体外Ufmylation实验；使用放线菌酮追踪实验检测UFL1缺失对ET-1稳定性的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 角质形成细胞无血清培养基 | Gibco | 10725-018 |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Procell | CM-0109 | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| RNA干扰 | 脂质体转染试剂3000 | Invitrogen | -- |
| 组织染色 | 甲苯胺蓝染色试剂盒 | Sangon Biotech | -- |
| ELISA | ET-1 ELISA试剂盒 | mmbio | MM-0561M2 |
| Western blot | 抗UFL1抗体 | Bethyl Laboratories | A303-456A |
| 抗UFL1抗体 | Sigma | HPA030559 | |
| 抗内皮素-1抗体 | Proteintech | 12191-1-AP | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3597S | |
| 抗Flag抗体 | Cell Signaling Technology | 3177S | |
| 抗UFM1抗体 | Abcam | ab109305 | |
| 抗GAPDH抗体 | HuaAn Biotechnology | M1310-2 | |
| 免疫组化 | 抗UFL1抗体 | Bethyl Laboratories | A303-456A |
| 抗内皮素-1抗体 | Proteintech | 12191-1-AP | |
| 抗Ki-67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| TUNEL染色 | TUNEL检测试剂盒 | Recordbio Biological Technology | -- |
| RNA-seq | Trizol试剂 | -- | -- |
| RNA Nano 6000检测试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| NEBNext® Ultra RNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 5×FastKing逆转录预混液 | TIANGEN | -- | |
| SYBR Green Supermix | Bio-Rad | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| Ufmylation检测 | 抗Flag M2亲和凝胶 | Sigma | -- |
| 谷胱甘肽琼脂糖凝胶 | GE Healthcare | -- | |
| Western blot成像 | MP 5000 VersaDoc成像系统 | BioRad | -- |
| 统计 | GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因敲除小鼠模型 | 小鼠基因型：Ufl1f/f KRT14Cre/+（CKO）和Ufl1f/+或Ufl1f/f（CTRL）；年龄3个月和16个月；SPF饲养环境 阅读提示：Materials and methods: Generation of Ufl1f/f KRT14Cre/+ mice and genotyping; Results: Generation of Ufl1f/f KRT14Cre/+mice |
| 组织学与免疫组化 | 组织处理：4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度3微米；抗体稀释度：UFL1 1:100，ET-1 1:100，Ki-67 1:200 阅读提示：Materials and methods: Histology, immunohistochemistry and special staining |
| 细胞培养与处理 | HaCaT细胞培养在Keratinocytes-SFM；HEK293T细胞培养在DMEM+10%FBS；siRNA和shRNA序列；转染试剂Lipofectamine 3000 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and reagents |
| RNA-seq分析 | 样本：3月龄小鼠耳组织；生物学重复：每组2个；差异表达基因筛选标准：adjusted p-value<0.05；分析软件：DESeq2 (1.20.0) 阅读提示：Materials and methods: RNA sequencing; Results: Global transcriptome analysis of ear |
| Ufmylation检测 | HEK293T细胞转染的质粒：UBA5, UFC1, UFL1, UFM1, DDRGK1，及ET-1；UFM1变体：UFM1ΔC2（活性），UFM1ΔC3（无活性）；裂解缓冲液成分；免疫沉淀用anti-Flag M2亲和凝胶 阅读提示：Materials and methods: Assays for ufmylation in vivo and in vitro; Results: Ufl1 deletion upregulates Endothelin-1 synthesis |
| 蛋白质稳定性实验 | 细胞处理：UFL1敲低HaCaT（sh-UFL1）和对照（sh-NC）；放线菌酮浓度100 μg/ml；处理时间点 阅读提示：Results: Ufl1 deletion upregulates Endothelin-1 synthesis; Figure 5E |