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        超声可见的工程细菌用于肿瘤化学免疫治疗

        Ultrasound-visible engineered bacteria for tumor chemo-immunotherapy.

        作者信息Yaozhang Yang, Yuanyuan Wang, Fengyi Zeng, Yuhao Chen, Zhiyi Chen, Fei Yan
        PMID38640931
        期刊Cell Rep Med
        发布时间2024-05-21
        DOI10.1016/j.xcrm.2024.101512
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含体外细胞实验、皮下肿瘤模型、系统给药模型、免疫记忆模型等多层级验证，并进行了机制和功能验证。

        主要模型

        4T1乳腺癌细胞 RAW264.7巨噬细胞 DC2.4树突状细胞 BALB/c小鼠4T1皮下肿瘤模型

        重点核对

        工程细菌Ec@DIG-GVs的构建（含ARG1基因和热响应IFN-γ基因电路） hHIFU照射参数（频率1 MHz，占空比66.7%，脉冲周期150 ms，峰值负声压4.93 MPa） DOX的装载量（初始浓度1.8 mg/mL时约20.6 μg）和释放条件（pH 5.4、6.5） 治疗剂量（2.8×10^7 CFU细菌，100 μg anti-PD-L1抗体） 治疗时间安排（细菌注射后48小时hHIFU照射，重复一次）

        摘要

        杨等人通过基因工程改造细菌，使其携带声学报告基因和热响应性IFN-γ基因，并用阿霉素（DOX）进行化学修饰。这些含有气囊的细菌可以引导高强度聚焦超声（hHIFU）精确诱导IFN-γ基因的表达。IFN-γ和DOX的协同作用激活肿瘤特异性T细胞反应，提高抗肿瘤疗效。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        如何对肿瘤靶向的工程细菌进行超声可视化，并引导高强度聚焦超声精确激活治疗基因表达和化学药物递送，以实现协同抗肿瘤效果？
        核心机制
        IFN-γ和DOX协同作用：IFN-γ诱导巨噬细胞M2向M1极化、促进树突状细胞成熟；DOX在酸性肿瘤微环境中释放，诱导免疫原性细胞死亡，激活肿瘤特异性T细胞反应。
        主要证据
        体外4T1细胞杀伤实验、巨噬细胞和DC细胞极化/成熟实验；体内4T1皮下肿瘤模型和系统给药模型中的肿瘤生长抑制、免疫细胞分析（流式细胞术）、肿瘤再挑战实验。
        研究意义
        提供了一种细菌介导的肿瘤化学免疫治疗新策略，通过超声引导的hHIFU实现远程可控基因表达和肿瘤内DOX递送。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        构建和表征工程细菌Ec@DIG-GVs

        构建含有气囊和热响应基因电路的工程细菌，并验证其超声成像能力和药物装载。

        将pTD103-ARG1质粒和pBV-IFN-γ（或mCherry）质粒转化至大肠杆菌MG1655，经AHL诱导产生气囊；通过EDC/NHS化学反应将DOX偶联到细菌表面。

        2

        体外验证超声成像引导的基因表达和药物释放

        验证超声对比成像能力、hHIFU激活基因表达和pH响应性DOX释放。

        琼脂凝胶中检测不同浓度细菌的超声信号；hHIFU照射后检测mCherry和IFN-γ表达；在不同pH条件下检测DOX释放和细胞摄取。

        3

        体外肿瘤细胞杀伤和免疫激活

        评估IFN-γ和DOX的协同杀伤肿瘤细胞和免疫激活能力。

        用不同处理的细菌上清孵育4T1细胞、RAW264.7巨噬细胞和DC2.4细胞，检测细胞活力、凋亡、CRT暴露、HMGB1释放、巨噬细胞极化、DC成熟和细胞因子分泌。

        4

        体内超声追踪和抗肿瘤疗效评估

        验证Ec@DIG-GVs的超声成像能力、肿瘤靶向性和抗肿瘤疗效。

        4T1皮下肿瘤小鼠瘤内或静脉注射细菌，进行超声成像、hHIFU照射，监测肿瘤生长、生存期、免疫细胞浸润和细胞因子水平。

        5

        联合PD-L1阻断的长期免疫记忆评估

        评估联合PD-L1阻断能否增强抗肿瘤疗效并建立长期免疫记忆。

        4T1肿瘤小鼠分为四组，给予Ec@DIG-GVs+hHIFU联合anti-PD-L1治疗，随后进行肿瘤再挑战实验，检测记忆T细胞和细胞因子水平。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        相差显微镜透射电子显微镜紫外可见光谱
        验证细胞功能变化
        CCK-8实验流式细胞术活/死细胞染色
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹酶联免疫吸附测定免疫荧光SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
        验证免疫效应
        流式细胞术酶联免疫吸附测定肿瘤再挑战
        验证机制链路
        免疫荧光染色流式细胞术
        评估体内效果
        肿瘤生长曲线生存分析H&E染色TUNEL检测Ki67染色
        数据分析与统计
        单因素方差分析双因素方差分析t检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细菌表面修饰阿霉素Ruixi Biotechnology Co.--
        细菌标记ICG-NHSRuixi Biotechnology Co.--
        DiOThermo Fisher Scientific Co.V22886
        偶联反应EDCAladdinE106172
        NHSAladdinH109330
        诱导表达N-(β-酮己酰)-L-高丝氨酸内酯SigmaK0037
        细胞培养DMEM培养基GibcoC11995500BT
        胎牛血清Gibco10270-106
        青霉素/链霉素Gibco15140122
        RPMI 1640培养基GibcoC11875500BT
        细菌筛选卡那霉素AladdinK103026
        组织消化胶原酶VYEASEN40511ES60
        流式分析FACS缓冲液Biolegend420201
        红细胞裂解红细胞裂解液Biolegend420301
        细胞内染色True-Nuclear转录因子缓冲液套装Biolegend424401
        蛋白提取RIPA裂解液CWBIOCW2333
        细胞核染色DAPIBeyotime Biotechnology Co.C1005
        凋亡检测Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒Beyotime Biotechnology Co.C1062M
        细胞因子检测IFN-γ检测试剂盒Dakewe Bioengineering Co.1210002
        IL-12检测试剂盒Dakewe Bioengineering Co.1211202
        IL-6检测试剂盒Dakewe Bioengineering Co.1210602
        IL-1β检测试剂盒Dakewe Bioengineering Co.1210122
        TGF-β检测试剂盒Dakewe Bioengineering Co.1217102
        HMGB1检测试剂盒Saipei Biotechnology Co.SP14752
        免疫治疗抗PD-L1抗体Biolegend124338
        细菌构建pBV220质粒Miaoling Bioscience & Technology Co.--
        pTD103-ARG1质粒Addgene106475
        细菌菌株大肠杆菌MG1655Angyubio Biotechnology Co.G6057
        细胞系4T1细胞Pricella Biotechnology Co.CL-0007
        RAW264.7细胞Pricella Biotechnology Co.CL-0190
        DC2.4细胞Fuheng Biotechnology Co.FH0510
        动物模型BALB/c小鼠Zhuhai Bes Test Bio-Tech Co.--

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        细菌构建和诱导
        菌株：大肠杆菌MG1655；质粒：pTD103-ARG1和pBV-IFN-γ；抗生素：卡那霉素50 μg/mL和氨苄青霉素100 μg/mL；AHL诱导浓度和时间：3 nM、22小时、30°C。
        阅读提示：Methods小节“Preparation of engineered bacteria with a two-plasmid system”和“Induction of GVs and construction of Ec@DIG-GVs bacteria”。
        体外超声成像和hHIFU照射
        超声成像参数（频率21 MHz，功率20%）；hHIFU参数（温度：45°C，时间：25分钟，频率1 MHz，占空比66.7%，峰值负声压4.93 MPa）。
        阅读提示：Methods小节“In vitro ultrasound contrast imaging of Ec@DIG-GVs bacteria”和“In vitro precise control of mCherry expression by ultrasound contrast imaging-guided hHIFU irradiation”。
        DOX装载和释放
        DOX偶联条件（EDC/NHS活化，细菌浓度8×10^8 CFU，室温反应10分钟）；释放条件（pH 5.4、6.5、7.4，37°C孵育）。
        阅读提示：Methods小节“Induction of GVs and construction of Ec@DIG-GVs bacteria”和“Cellular uptake of DOX”。
        体内抗肿瘤治疗
        肿瘤模型建立（4T1细胞注射量1×10^6）；细菌注射剂量（2.8×10^7 CFU）；hHIFU照射时间（25分钟，45°C）；治疗周期（每周一次）；分组（PBS、Ec@G-GVs+hHIFU、Ec@DIG-GVs、Ec@IG-GVs+hHIFU、Ec@DIG-GVs+hHIFU）。
        阅读提示：Methods小节“In vivo anti-tumor treatment”和“Experimental model and subject details”。
        联合PD-L1阻断
        anti-PD-L1剂量（100 μg/只）；给药时间（第4、11、13天）；肿瘤再挑战接种量（5×10^5 4T1细胞）。
        阅读提示：Methods小节“The anti-tumor treatment of Ec@DIG-GVs+hHIFU combined with anti-PD-L1 antibody and tumor rechallenge study”。

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