建立执行者caspase激活报告系统
实现对经历执行者caspase激活的细胞的标记和长期追踪
开发了哺乳动物CasExpress（mCasExpress）报告系统，包含caspase激活的DNA重组酶Flp（Lyn11-NES-DEVD-Flp）和Flp活性报告基因（FRT-STOP-FRT-ZsGreen），并置于多西环素诱导启动子控制下。通过慢病毒感染将报告系统导入HEY和A2780细胞。
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失巢凋亡通过升高的p38 MAPK激活赋予卵巢癌细胞增加的恶性程度
Anastasis confers ovarian cancer cells increased malignancy through elevated p38 MAPK activation.
实验完整度
高包含体外细胞模型（HEY、A2780）验证表型、体内动物模型（皮下异种移植、腹膜转移）验证功能、转录组学分析及机制验证（p38、caspase依赖性）。
主要模型
HEY卵巢癌细胞系 A2780卵巢癌细胞系 NCG小鼠皮下异种移植模型 NCG小鼠腹膜转移模型
重点核对
TRAIL 400 ng/μl或PTX 1 μM处理卵巢癌细胞24小时以诱导凋亡 使用mCasExpress报告系统标记并分选经历caspase激活的存活的ZsGreen+细胞 p38抑制剂SB203580处理以验证p38对表型的影响 使用siRNA敲低MAPK14验证p38α的作用 动物模型使用NCG小鼠，皮下注射1×10^6 HEY或5×10^6 A2780细胞
摘要
执行者caspase的激活曾被认为是凋亡的不可逆转点。然而，近年来越来越多的证据表明，细胞可以通过一个称为失巢凋亡的过程，在凋亡刺激下存活并经历执行者caspase激活。在本研究中，我们开发了一个报告系统mCasExpress，用于追踪经历执行者caspase激活后存活的哺乳动物细胞。我们证明了失巢凋亡的卵巢癌细胞在短暂暴露于凋亡刺激TRAIL或紫杉醇后获得增强的迁移能力。此外，失巢凋亡的癌细胞分泌更多的促血管生成因子，从而促进肿瘤血管生成、生长和转移。机制上，我们证明了p38 MAPK的激活以caspase依赖性方式响应凋亡应激以促进失巢凋亡，并且在凋亡刺激移除后，失巢凋亡癌细胞中p38的激活水平持续升高。重要的是，p38对于失巢凋亡细胞增强的迁移和血管生成能力是必需的。我们的工作揭示了失巢凋亡作为肿瘤血管生成和转移的潜在驱动因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 卵巢癌细胞能否在凋亡应激下通过失巢凋亡存活，以及失巢凋亡是否赋予这些细胞新的表型特征从而促进肿瘤进展。
- 核心机制
- 凋亡应激下，执行者caspase激活诱导p38 MAPK激活，p38促进失巢凋亡；在失巢凋亡细胞中，p38活性持续升高，驱动细胞迁移和促血管生成基因表达，从而增强肿瘤血管生成、生长和转移。
- 主要证据
- 使用mCasExpress报告系统标记和分选经历执行者caspase激活的存活细胞，通过transwell实验证明其迁移能力增强，通过ELISA、HUVEC小管形成和体内Matrigel实验证明其促血管生成能力增强，并在皮下和腹膜转移模型中证实其体内促进肿瘤生长和转移。
- 研究意义
- 这些发现将失巢凋亡确定为肿瘤血管生成和转移的潜在驱动因素，提示在化疗期间靶向失巢凋亡可能防止肿瘤复发和转移。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证卵巢癌细胞对凋亡刺激的失巢凋亡反应
确认卵巢癌细胞在TRAIL或PTX处理后能存活并经历执行者caspase激活
用TRAIL或PTX处理携带GC3AI或mCasExpress报告系统的HEY和A2780细胞24小时，然后移除药物并允许细胞恢复。通过流式细胞术和活细胞成像监测caspase激活（GC3AI+或ZsGreen+）和细胞存活。
转录组分析失巢凋亡细胞的基因表达变化
揭示失巢凋亡细胞与未经历caspase激活的细胞之间的转录组差异
对从HEY-PTX-ZsGreen+、HEY-PTX-ZsGreen−和对照细胞中提取的RNA进行RNA测序，并进行PCA、GO和KEGG富集分析。通过RT-qPCR验证迁移和血管生成相关基因的表达。
体外验证失巢凋亡细胞的迁移和促血管生成能力
评估失巢凋亡细胞是否获得增强的迁移和促血管生成功能
通过transwell实验检测细胞迁移能力。收集失巢凋亡细胞的条件培养基，通过ELISA检测分泌的VEGFA、VEGFC、TNF-α和PGE2水平，并通过HUVEC transwell迁移和管形成实验评估对血管内皮细胞的影响。
体内验证失巢凋亡细胞促进肿瘤生长和血管生成
评估失巢凋亡细胞在体内对肿瘤生长和血管生成的影响
将分选的ZsGreen+、ZsGreen-和对照细胞皮下注射到NCG小鼠中，监测肿瘤体积、重量、Ki67和CD31染色。同时，使用条件培养基进行Matrigel植入实验，评估体内血管生成。
体内验证失巢凋亡细胞的转移能力
评估失巢凋亡细胞在体内的转移能力是否增强
将表达荧光素酶的ZsGreen+、ZsGreen−和对照细胞腹膜内注射到NCG小鼠中，通过生物发光成像监测肿瘤生长和播散，并分析腹膜结节数量、重量及器官转移情况。
机制验证：p38在失巢凋亡及增强恶性表型中的作用
验证p38激活是否为失巢凋亡及其增强的迁移和促血管生成能力所必需
通过Western blot检测不同细胞群体中p38、JNK、ERK、Akt、NFκB的磷酸化水平。使用p38抑制剂SB203580或siRNA敲低MAPK14，评估对促血管生成基因表达、HUVEC管形成、体内血管生成和细胞迁移的影响。同时，验证caspase活性对p38激活和表型的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM（高糖）培养基 | ThermoFisher Scientific | 11995-040 |
| 胎牛血清 | AusgeneX | FBS500-S | |
| 青霉素-链霉素 | Spark Jade | CM0004-100ml | |
| 内皮细胞基础培养基 | Zhongqiaoxinzhou Biotech | 1001 | |
| 胎牛血清 | Zhongqiaoxinzhou Biotech | 0025 | |
| 内皮细胞生长添加物 | ZhongqiaoXinZhou Biotech | 1052 | |
| 青霉素-链霉素 | Zhongqiaoxinzhou Biotech | 0503 | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| 细胞处理 | TRAIL（肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体） | -- | -- |
| 紫杉醇 | -- | -- | |
| Q-VD-OPh（泛caspase抑制剂） | -- | -- | |
| SB203580（p38抑制剂） | -- | -- | |
| 脱氢紫堇碱 | -- | -- | |
| 质粒构建 | pCAG-FlpO质粒 | Addgene | 89574 |
| pCW57-MCS1-P2A-MCS2-hygro质粒 | Addgene | 80922 | |
| pJFRC206-10XUAS-FRT-STOP-FRT-myr:smGFP:V5质粒 | Addgene | 63168 | |
| pLVX-shRNA2-ZsGreen载体 | Clontech | 632179 | |
| pCDH-puro-CMV-GC3AI质粒 | Addgene | 78910 | |
| In-Fusion克隆试剂盒 | TakaraBio | 639650 | |
| 病毒包装与感染 | pCMV-dR8.2 dvpr质粒 | Addgene | 8455 |
| pCMV-VSV-G质粒 | Addgene | 8454 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | 13778150 | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778030 |
| 流式细胞术与分选 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| MoFlo流式分选仪 | Beckman Coulter | -- | |
| RNA测序 | Trizol试剂 | ThermoFisher Scientific | 15596-026 |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒（Illumina） | New England Biolabs | 7530 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| Illumina Novaseq6000测序仪 | Illumina | -- | |
| RNA提取与qRT-PCR | RNA快速提取试剂盒 | Spark Jade | Ac1001 |
| 实时荧光定量PCR系统 | Vanzyme | Q411-03 | |
| qTOWER荧光定量PCR仪 | Analytikjena | -- | |
| Western Blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Spark Jade | EC0001 | |
| 化学发光底物 | Spark Jade | ED0016 | |
| Tanon 5200多色化学发光成像仪 | Tanon Science & Technology Co. | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Falcon | 353097 |
| Opti-MEM培养基 | ThermoFisher Scientific | 31985-088 | |
| 结晶紫 | Solarbio | G1065 | |
| IX73倒置显微镜 | Olympus | -- | |
| HUVEC管形成实验 | Matrigel基质胶 | BD Biosciences | 354234 |
| IX73倒置显微镜 | Olympus | -- | |
| Image J软件 | -- | -- | |
| EdU增殖实验 | BeyoClick EdU-594试剂盒 | Beyotime | C0078S |
| BX51显微镜 | Olympus | -- | |
| CCK-8实验 | CCK-8细胞增殖检测试剂盒 | Spark Jade | CT0001 |
| Molecular Devices酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| ELISA | PGE2 ELISA试剂盒 | Meimian | MM0162H2 |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Meimian | MM0122H2 | |
| VEGFA ELISA试剂盒 | Meimian | MM-14698H2 | |
| VEGFC ELISA试剂盒 | Meimian | MM-0113H2 | |
| 体内Matrigel植入实验 | Drabkin试剂盒 | Sigma | 5941 |
| 动物实验 | 裸鼠 | GemPharmatech | D000521 |
| NCG小鼠 | GemPharmatech | T001475 | |
| 腹膜转移模型 | IVIS Spectrum小动物活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 免疫组织化学 | 柠檬酸抗原修复缓冲液 | -- | -- |
| BX51显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系（HEY、A2780、HUVEC）来源及培养条件，凋亡诱导剂（TRAIL 400 ng/μl、PTX 1 μM）浓度，处理时间24小时，caspase抑制剂qVD浓度50 μM，p38抑制剂SB203580浓度，DOX浓度及处理时间。 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment, 图1图例 |
| mCasExpress报告系统 | DOX浓度（1 μg/ml）和处理时间（6小时），报告系统构建详细信息（质粒、克隆方法），ZsGreen+细胞分选策略。 阅读提示：Methods: Plasmid construction, Results: mCasExpress reporter labels cells section |
| 转录组分析 | RNA-seq平台（Illumina Novaseq6000），建库试剂盒（NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit），差异表达基因筛选阈值，GO和KEGG分析工具。 阅读提示：Methods: RNA sequencing, Results: Anastasis enriches transcriptome section |
| 体外功能验证 | Transwell实验细胞数（HEY或HUVEC 2.5×10^4，A2780 5×10^4），迁移时间（HEY/HUVEC 24小时，A2780 48小时），HUVEC管形成实验细胞数（3×10^4），Matrigel体积（50 μl/孔），ELISA检测因子。 阅读提示：Methods: Transwell assay, HUVEC tube formation assay, ELISA |
| 体内动物实验 | 小鼠品系（裸鼠、NCG小鼠），周龄（4周龄或5周龄），细胞注射数量（皮下：HEY 1×10^6、A2780 5×10^6；腹腔：HEY 5×10^6、A2780 1×10^7），肿瘤体积测量频率，终点时间，样本量。 阅读提示：Methods: Animals, Subcutaneous xenograft tumor model, Peritoneal metastasis model, figure legends of Figs. 4, 5 |
| p38机制验证 | p38抑制剂SB203580浓度，siRNA序列及转染剂量，Western blot检测的磷酸化蛋白（p38、JNK、ERK、Akt、NFκB），qVD处理时间点，恢复期抑制剂维持。 阅读提示：Methods: siRNA transfection, Western Blot, Results: p38 is activated by caspases and p38 activation sections, figure legends of Figs. 6 and 7 |