确定 NFI 在不同动物模型中的最佳注射参数
探索 NFI 在不同弹簧力下实现皮下或肌肉注射的可行性及药物扩散效果。
在大鼠和家兔的侧腿注射含亚甲蓝的 mRNA-LNP，解剖后观察扩散范围。
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一种用于 SARS-CoV-2 mRNA-LNP 疫苗接种的高效无针注射递送系统
A highly efficient needle-free-injection delivery system for mRNA-LNP vaccination against SARS-CoV-2.
实验完整度
高包含多种体内模型（小鼠、大鼠、家兔）的免疫原性评价，结合理化分析、冷冻电镜、假病毒和活病毒中和试验，以及异源加强策略验证。
主要模型
BALB/c 小鼠 SD 大鼠 新西兰兔 Huh-7 细胞系
重点核对
NFI 弹簧力设置 mRNA-LNP 剂量 免疫途径（肌肉或皮下） 异源加强疫苗类型 中和抗体检测方法
摘要
尽管已经开发出多种疫苗来应对 2019 冠状病毒病 (COVID-19) 大流行，但严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 的持续且不可预测的突变需要创新且不懈的解决方案来应对由此产生的免疫逃逸并建立可持续的免疫屏障。这里我们介绍一种疫苗递送系统，该系统将无针注射 (NFI) 装置与 SARS-CoV-2-Spike 特异性 mRNA-脂质纳米颗粒 (LNP) 疫苗相结合。与传统针头注射 (NI) 相比，其优点是疼痛更轻且免疫原性显著增加。从理化及生物活性分析来看，mRNA-LNP 的结构在 NFI 后保持稳定，这与 LNP 在 NFI 高压条件下易被破坏的观点相矛盾。此外，通过 NFI 递送的 mRNA-LNP 疫苗诱导针对 SARS-CoV-2 变异株的结合抗体和中和抗体显著高于通过 NI 递送的相同疫苗。在先前接种过非 BA.5 特异性 mRNA-LNP 或其他 COVID-19 疫苗的家兔中，通过 NFI 进行 BA.5-LNP 疫苗的异源接种增强了对 Omicron BA.5 变异株中和抗体的产生。NFI 参数可调整以通过皮下或肌肉注射递送 mRNA-LNP。综上所述，我们的结果表明，基于 NFI 的 mRNA-LNP 疫苗接种是传统基于 NI 的 mRNA-LNP 疫苗接种的有效替代方案。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NFI 递送能否有效替代传统针头注射，用于 SARS-CoV-2 mRNA-LNP 疫苗的接种？
- 核心机制
- NFI 产生的高速液体射流可在组织中分散 mRNA-LNP 颗粒，增加与免疫细胞的接触，从而增强免疫应答。
- 主要证据
- 在大鼠和家兔模型中，NFI 递送的 KEN445-LNP 诱导的抗体水平与 NI 相当或更高，尤其针对 Omicron BA.5 的中和抗体显著升高；冷冻电镜显示 NFI 处理不影响 LNP 颗粒完整性；理化分析表明粒径、多分散指数、包封率等保持稳定。
- 研究意义
- 基于 NFI 的 mRNA-LNP 疫苗接种可作为传统 NI 方式的有效替代方案，有望克服针头恐惧症，并提高未来疫苗接种的可及性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
mRNA-LNP 疫苗的构建与表征
设计并制备针对 SARS-CoV-2 刺突蛋白的 mRNA 疫苗，验证其免疫原性。
通过体外转录合成编码 KEN445 或 BA.5 突变刺突蛋白的 mRNA，包封于脂质纳米颗粒中，并在小鼠中评估其免疫原性。
NFI 对 mRNA-LNP 颗粒稳定性的影响
评估 NFI 高压条件是否破坏 mRNA-LNP 的结构和功能。
将重悬的 mRNA-LNP 通过不同弹簧力的 NFI 注射，分析粒径、Zeta电位、包封率，并通过冷冻电镜观察颗粒形态。
NFI 与 NI 递送在大鼠中的免疫效果比较
比较 NFI 和 NI 递送 mRNA-LNP 疫苗诱导的体液免疫应答。
大鼠通过 NFI 或 NI 接受两次疫苗注射，通过 ELISA 检测结合抗体，假病毒中和实验检测中和抗体。
家兔中 NFI 递送 mRNA-LNP 及异源加强免疫效果评估
验证 NFI 递送 mRNA-LNP 疫苗在较大动物中的有效性，并评估 BA.5-LNP 作为异源加强剂的效果。
家兔先接种两剂 KEN445-LNP 或对照疫苗，再接种 BA.5-LNP 加强，通过活病毒中和实验检测针对 Omicron BA.5 的中和抗体。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 无针注射递送 | QS-P 无针注射装置 | Quinovare | -- |
| mRNA 合成 | T7 RNA 聚合酶 | Vazyme | -- |
| N-1-甲基假尿苷-5-三磷酸 | Synthgene | -- | |
| LNP 制备 | 微流控混合器 INano P | MicroNano | -- |
| 可电离阳离子脂质 | tricisionbio Biological Technology Co., Ltd. | -- | |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 | AVT | -- | |
| 胆固醇 | AVT | -- | |
| 聚乙二醇脂质 | AVT | -- | |
| LNP 表征 | Zetasizer Nano ZS | Malvern | -- |
| RiboGreen 检测试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| 疫苗及加强接种 | BIBP 灭活疫苗 | Sinopharm | -- |
| 重组蛋白疫苗 | SinoCellTech | -- | |
| 抗体检测 | 抗大鼠 IgG F(ab)2-HRP 二抗 | Sino Biological | -- |
| 抗兔 IgG Fc-HRP 二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| 中和抗体检测 | 抗 SARS-CoV-2 中和抗体滴度血清学检测试剂盒 | ACRO Biosystems | -- |
| 假病毒中和试验 | 荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| 被动裂解 5x 缓冲液 | Promega | -- | |
| CentroXS3 LB 960 微板发光检测仪 | -- | -- | |
| 活病毒中和试验 | Vero 细胞 | Procell | -- |
| Spike 表达检测 | ELISA 试剂盒 | Sino Biological | -- |
| 冷冻电镜 | Thermo Fisher Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher | -- |
| Quantifoil Au R1.2/1.3 载网 | -- | -- | |
| Thermo Fisher Titan Krios G3i 电子显微镜 | Thermo Fisher | -- | |
| Gatan K3 直接电子计数相机 | Gatan | -- | |
| EPU | -- | -- | |
| MotionCor2 | -- | -- | |
| CTFFIND4.1 | -- | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.3.0 | -- | -- |
| 图像分析 | ImageJ 软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NFI 注射参数探索 | 弹簧力（大鼠200-280N，家兔280-365N）以及注射深度和扩散面积。 阅读提示：见 Materials and methods 中 'NFI-based dispersive depth-exploration of contents in animal models' 及 Figure 1c-d |
| mRNA-LNP 疫苗制备 | mRNA 序列（KEN445 或 BA.5 突变）、脂质组成、N/P 比、微流控参数、冻干保护剂（蔗糖）浓度。 阅读提示：见 Materials and methods 中 'Plasmid construction and preparation of mRNA' 和 'LNP preparation, mRNA encapsulation and lyophilization' |
| 免疫接种 | 动物品系和年龄、剂量、注射途径（肌肉或皮下）、免疫次数和间隔。 阅读提示：见 Materials and methods 中 'Vaccination procedure' 及对应的 Figure 图注 |
| 抗体检测 | ELISA 包被抗原、血清稀释梯度、二抗种类和浓度；中和试验使用的假病毒或活病毒变异株、细胞系、感染剂量。 阅读提示：见 Materials and methods 中 'Analyses of antigen-specific binding antibody'、'Angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) inhibition assay'、'SARS-CoV-2 pseudovirus neutralization assay' 和 'SARS-CoV-2 live-virus neutralization assay' |