遗传电路的构建与体外活性验证
验证所构建的CMV-siRTNF-α遗传电路能够在体外合成功能性TNF-α siRNA，并有效抑制TNF-α表达。
将TNF-α siRNA序列插入pre-miR-155骨架，构建CMV-siRTNF-α质粒；在ANA-1细胞中转染后LPS刺激，检测TNF-α mRNA和分泌水平；在HEK293T细胞中检测siRNA表达及包装入sEV。
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体内自组装siRNA作为溃疡性结肠炎联合治疗的模态
In vivo self-assembled siRNA as a modality for combination therapy of ulcerative colitis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（ANA-1、HEK293T）、急性/慢性DSS和TNBS诱导的UC模型、IL-10−/−自发结肠炎模型，以及AAV载体体内验证，涵盖了从机制到功能的多个证据层级。
主要模型
DSS诱导的急性溃疡性结肠炎小鼠模型 DSS诱导的慢性溃疡性结肠炎小鼠模型 IL-10基因敲除小鼠自发慢性结肠炎模型 TNBS诱导的结肠炎小鼠模型
重点核对
急性UC模型中，2.5% DSS饮水7天诱导，尾静脉注射20 mg/kg CMV-siRTNF-α或CMV-siRT+B+I，每日一次共7次。 慢性UC模型中，2.5% DSS饮水1周/正常饮水2周循环3次，注射10 mg/kg CMV-siRT+B+I，每隔2天一次共3次。 IL-10−/−小鼠模型中，11周龄雄鼠，每两天尾静脉注射10 mg/kg CMV-siRT+B+I，共14次。 AAV8-TBG-siRT+B+I单次注射100 μL（3×10^12 V.G/mL），在DSS慢性UC模型中评估长期疗效。 AAV9-CMV-siRT+B+I单次注射100 μL（1×10^12 V.G/mL），在DSS慢性UC模型中评估长期疗效。
摘要
鉴于溃疡性结肠炎的复杂性，可能需要靶向溃疡性结肠炎的多个致病基因和通路的联合治疗。不幸的是，目前的治疗策略通常基于独立的化合物或单克隆抗体，联合治疗的全部潜力尚未在溃疡性结肠炎的治疗中得到实现。在这里，我们开发了一种合成生物学策略，将自然存在的小细胞外囊泡循环系统与人工遗传电路相结合，重编程雄性小鼠的肝脏以将多种siRNA自组装到分泌性小细胞外囊泡中，并通过循环小细胞外囊泡促进体内递送siRNA，用于溃疡性结肠炎小鼠模型的联合治疗。特别是，重复注射设计用于同时抑制TNF-α、B7-1和整合素α4的多靶点遗传电路，可迅速缓解肠道炎症，并通过抑制结肠巨噬细胞中的促炎级联反应、抑制T细胞的共刺激信号以及阻断T细胞向炎症部位的归巢，发挥针对溃疡性结肠炎的协同治疗作用。更重要的是，我们设计了一种AAV驱动的遗传电路，仅通过一次注射即可诱导对TNF-α、B7-1和整合素α4的实质性和持久性抑制。总的来说，这项研究建立了一种可行的溃疡性结肠炎联合治疗策略，这可能为需要两种或更多独立化合物或抗体的传统生物疗法提供一种替代方案。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究体内自组装siRNA是否能够通过多靶点联合策略有效治疗溃疡性结肠炎。
- 核心机制
- 多靶点遗传电路通过CMV或TBG启动子驱动siRNA表达，经肝脏自组装入sEV，递送至结肠巨噬细胞和CD4+ T细胞，同时抑制TNF-α、B7-1和整合素α4，从而发挥协同治疗作用。
- 主要证据
- 在DSS急性/慢性UC模型和IL-10−/−自发结肠炎模型中，CMV-siRT+B+I显著缓解体重下降、结肠缩短、DAI评分、组织学损伤，并降低靶基因表达。
- 研究意义
- 该研究建立了一种基于体内自组装siRNA的联合治疗策略，为需要多种独立化合物或抗体的传统生物疗法提供了一种潜在替代方案。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内自组装sEV的评估
评估CMV-siRTNF-α在体内能否触发肝脏产生TNF-α siRNA并包装入sEV分泌至血液。
DSS急性UC模型小鼠静脉注射5 mg/kg CMV-siRTNF-α，检测肝脏和血浆中siRNA水平，通过Ago2免疫沉淀和sEV分离验证siRNA的包装形式。
离体活性验证
验证体内组装的TNF-α siRNA-sEV能否被巨噬细胞摄取并抑制TNF-α表达。
将DSS小鼠血浆sEV与巨噬细胞共孵育，LPS刺激后检测TNF-α mRNA和分泌蛋白水平。
siRNA在炎症黏膜免疫细胞中的递送追踪
确认sEV包裹的TNF-α siRNA能够被递送至结肠巨噬细胞和CD4+ T细胞等免疫细胞。
DSS小鼠注射CMV-siRTNF-α后，检测结肠、脾、肾中siRNA累积，通过FISH和免疫细胞分离定量siRNA在巨噬细胞、单核细胞和CD4+ T细胞中的水平。
急性UC模型中的疗效评估
评估CMV-siRTNF-α在急性DSS UC模型中的治疗效果。
DSS急性UC小鼠分别注射CMV-scrR、不同剂量CMV-siRTNF-α或英夫利西单抗，评估体重、DAI、结肠长度、炎症因子、组织学等指标。
chronic UC模型中的疗效评估
评估CMV-siRTNF-α在慢性DSS UC模型中的疗效和安全性。
慢性DSS UC小鼠注射CMV-siRTNF-α或英夫利西单抗，评估症状、组织学、分子标志物及肝肾毒性。
多靶点遗传电路的构建与筛选
筛选有效的靶点并构建同时沉默TNF-α、B7-1和整合素α4的多靶点遗传电路CMV-siRT+B+I。
基于文献筛选候选靶点，构建单一靶点电路并评估疗效，选择B7-1和整合素α4与TNF-α组合，构建串联表达多个siRNA的CMV-siRT+B+I。
多靶点遗传电路在慢性UC中的协同疗效
评估多靶点CMV-siRT+B+I在慢性UC模型中是否产生协同治疗效果。
慢性DSS UC小鼠注射PBS、CMV-scrR、CMV-siRTNF-α、CMV-siRIntegrin α4、CMV-siRB7-1或CMV-siRT+B+I，比较各组疗效。
多靶点siRNA的分子机制验证
验证CMV-siRT+B+I能同时抑制TNF-α、B7-1和整合素α4的表达。
检测结肠中TNF-α、B7-1、整合素α4的mRNA和蛋白水平，流式分析细胞表面B7-1和整合素α4，免疫荧光双染色，及E-cadherin黏附实验。
自发性结肠炎模型中的疗效验证
在IL-10−/−自发结肠炎模型中验证siRNA疗法的有效性。
IL-10−/−小鼠注射CMV-scrR、CMV-siRTNF-α、CMV-siRT+B+I或英夫利西单抗，评估体重、结肠长度、炎症因子、组织学及靶基因表达。
AAV载体驱动的长期疗效
开发AAV驱动的遗传电路以实现单次注射长期有效。
构建AAV9-CMV-siRTNF-α和AAV9-CMV-siRT+B+I，单次注射后建立慢性UC模型，评估长期疗效和靶基因抑制。
肝特异性AAV8-TBG系统的优化
实现siRNA的肝特异性表达和组装，避免脱靶效应。
构建AAV8-TBG-siRT+B+I，单次注射后诱导慢性UC，评估疗效、肝特异性表达和安全性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875093 |
| DMEM培养基 | Gibco | 10564011 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 动物模型诱导 | 葡聚糖硫酸钠 | Millipore | -- |
| 药物处理 | 英夫利西单抗 | Meilunbio | -- |
| sEV分离 | 总外泌体分离试剂盒 | Invitrogen | 4484450 |
| 碘克沙醇 | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| RNA免疫沉淀 | 抗Ago2抗体 | Cell Signaling Technology | 2897 |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | Santa Cruz | sc-2003 | |
| Western blot | CD63抗体 | Proteintech | 25682-1-AP |
| CD9抗体 | Proteintech | 20597-1-AP | |
| TSG101抗体 | Proteintech | 28283-1-AP | |
| 细胞分离 | 抗F4/80超纯微珠 | Miltenyi Biotec | 130-110-443 |
| CD4+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-454 | |
| 胶原酶 | Sangon Biotech | A004186-0001 | |
| RT-qPCR | TaqMan miRNA探针 | Applied Biosystems | -- |
| TaqMan™ MicroRNA检测试剂盒 | Applied Biosystems | 4440887 | |
| LightCycler 96实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 原位杂交 | miRCURY LNA miRNA检测探针 | Qiagen | -- |
| 免疫荧光染色 | 抗TNF-α抗体 | Abcam | ab183218 |
| 抗B7-1抗体 | Abcam | ab254579 | |
| 抗整合素α4抗体 | Cell Signaling Technology | 8440S | |
| 抗F4/80抗体 | Abcam | ab60343 | |
| CoraLite594标记山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00013-4 | |
| ProLong™ Gold抗淬灭封片剂（含DAPI） | Invitrogen | -- | |
| 流式细胞术 | 抗CD11b-PerCP抗体 | Biolegend | -- |
| 抗CD64-PE抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD206-AF488抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗Ly6C-APC抗体 | Biolegend | -- | |
| 小鼠Th1染色试剂盒 | MultiSciences | 70-KTH201-100 | |
| 小鼠Th17染色试剂盒 | MultiSciences | 70-KTH217-25 | |
| 黏附实验 | E-钙黏蛋白 | R&D Systems | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9软件 | GraphPad Prism Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 急性UC模型 | DSS浓度2.5%，饮水7天；注射剂量：CMV-siRTNF-α 0.5、5、20 mg/kg；给药方式：尾静脉注射，每日一次共7次；对照组：CMV-scrR 20 mg/kg 阅读提示：Methods: DSS-induced UC model; Figure 5a |
| 慢性UC模型 | DSS周期：2.5% DSS饮水1周/水2周循环3次；注射时间：每次DSS后第4天；剂量：10 mg/kg（多靶点）或20 mg/kg（单靶点）；频率：每隔2天一次共3次 阅读提示：Methods: DSS-induced chronic UC model; Figure 7a |
| IL-10−/−自发结肠炎模型 | 小鼠周龄：11周；注射剂量：10 mg/kg；频率：每两天一次共14次；对照组：英夫利西单抗10 mg/kg 阅读提示：Methods: Establishment of a spontaneous chronic colitis model in IL-10−/− mice; Figure 9 |
| AAV9治疗 | 病毒剂量：25-100 μL（1×10^12 V.G/mL）；单次注射；诱导慢性UC的时间：注射后3周；评估时间：第10周 阅读提示：Methods: AAV treatments; Supplementary Figure 16 |
| AAV8-TBG治疗 | 病毒剂量：25-100 μL（3×10^12 V.G/mL）；单次注射；同时诱导慢性UC；评估时间：第7周 阅读提示：Methods: AAV treatments; Figure 10a |