穿心莲内酯通过调控miR-137/BMP7轴抑制软骨细胞的纤维化表型并改善骨关节炎

Andrographolide suppresses fibrogenic phenotype of chondrocytes and ameliorates osteoarthritis by regulating miR-137/BMP7 axis.

作者信息Yaoyu Xiang, Xidan Hu, Xianguang Yang, Guoliang Wang, Yanlin Li, Fei Sun, En Song
PMID39691644
期刊J Orthop
发布时间2024-11-26
DOI10.1016/j.jor.2024.11.019

实验完整度

包含临床样本、IL-1β诱导细胞模型、OA动物模型,并进行了功能验证和机制验证。

主要模型

人原代软骨细胞 IL-1β诱导的软骨细胞炎症模型 前交叉韧带横断联合内侧半月板切除的OA小鼠模型 OA患者膝关节软骨标本

重点核对

人原代软骨细胞用10 ng/ml IL-1β处理48小时 穿心莲内酯处理浓度为20 μM miR-137 inhibitor及阴性对照以0.5 mg/kg/周膝关节注射 OA模型采用前交叉韧带横断联合内侧半月板切除 动物实验每组6只Balb/C小鼠

摘要

背景:软骨的病理性退化和纤维化软骨的形成是与骨关节炎(OA)进展相关的关键特征。本研究旨在探讨miR-137/BMP7通路在调节与OA相关的软骨细胞纤维化转变中的潜在功能,并评估穿心莲内酯的治疗潜力。方法:收集OA患者和未患OA个体的膝关节软骨样本,研究miR-137、BMP7和纤维化相关标志物的表达模式。使用白细胞介素(IL)-1β刺激的原代软骨细胞建立细胞模型,研究miR-137/BMP7轴在这些细胞纤维化转变中的作用。此外,我们利用OA动物模型来评估抗炎天然化合物穿心莲内酯对体内OA诱导的纤维形成的有益作用。结果:OA样本中纤维化和炎症因子水平升高与miR-137表达降低相关。在IL-1β处理的软骨细胞中,纤维化标志物上调,同时miR-137水平降低。miR-137的过表达通过负调控BMP7抑制纤维化。此外,穿心莲内酯处理能有效减弱软骨细胞的纤维化表型,并通过调节miR-137/BMP7通路减轻OA发病。结论:miR-137下调和BMP7过表达可能导致OA相关软骨细胞的纤维化特征。穿心莲内酯通过调节miR-137/BMP7轴减弱软骨细胞的纤维化表型并减轻OA的严重程度。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
探讨miR-137/BMP7轴在OA相关软骨细胞纤维化转变中的作用,并评估穿心莲内酯的治疗潜力。
核心机制
miR-137通过负调控BMP7抑制IL-1β诱导的软骨细胞纤维化;OA中miR-137下调导致BMP7过表达,促进纤维化,穿心莲内酯通过调节miR-137/BMP7轴抑制纤维化并减轻OA。
主要证据
OA患者软骨中miR-137降低,纤维化标志物和BMP7升高;IL-1β诱导的软骨细胞中miR-137下调,纤维化标志物上调;miR-137过表达或BMP7敲低逆转IL-1β效应;穿心莲内酯处理上调miR-137并抑制纤维化;体内OA模型中,穿心莲内酯恢复miR-137并改善关节病理。
研究意义
揭示miR-137/BMP7轴在软骨细胞纤维化转变中的关键作用,提示穿心莲内酯作为缓解OA的治疗潜力。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

临床样本分析

检测OA患者软骨中miR-137、纤维化标志物和炎症因子的表达变化。

收集OA患者和对照组膝关节软骨,通过RT-qPCR检测miR-137,免疫印迹检测COL1A1、COL3A1、α-SMA、BMP7、BMPR2,ELISA检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1。

2

细胞模型建立与验证

建立IL-1β诱导的软骨细胞炎症模型,验证miR-137和纤维化标志物的变化。

人原代软骨细胞用IL-1β处理,检测miR-137表达、纤维化标志物水平、细胞增殖和细胞因子分泌。

3

miR-137过表达功能实验

验证miR-137过表达对IL-1β诱导的纤维化和炎症的影响。

用miR-137 mimic或阴性对照转染软骨细胞,再用IL-1β刺激,检测纤维化标志物、BMP7、BMPR2、细胞增殖和细胞因子分泌。

4

机制验证实验

验证miR-137与BMP7的直接结合及BMP7在纤维化中的作用。

通过TargetScan预测结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证miR-137与BMP7 3'UTR结合,并用siRNA敲低BMP7观察对纤维化的影响。

5

穿心莲内酯体外实验

评估穿心莲内酯对IL-1β诱导的纤维化的影响,并验证其依赖性。

软骨细胞分别用IL-1β、IL-1β+穿心莲内酯、IL-1β+穿心莲内酯+miR-137抑制剂等处理,检测miR-137、纤维化标志物、细胞增殖和细胞因子分泌。

6

体内动物实验

验证穿心莲内酯在动物模型中对OA进展的保护作用,并确认依赖miR-137/BMP7轴。

构建OA小鼠模型,分组处理,检测关节组织学、miR-137和纤维化标志物。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
软骨细胞培养基ProcellCM-H107
白细胞介素-1βAbsinabs04626
穿心莲内酯MedChemExpressHY-N1490
脂质体3000转染试剂InvitrogenL30000-008
TRIzol试剂Invitrogen15596026
miRNA茎环逆转录试剂盒Hubei Apti Bioengineering Co., LtdIPD-X049
SYBR Premix Ex TaqII试剂TakaraRR82WR
RIPA裂解液KeyGenK10034
抗I型胶原蛋白1A1抗体Abcamab260043
抗III型胶原蛋白3A1抗体Abcamab184993
抗α-平滑肌肌动蛋白抗体Abcamab5694
抗骨形态发生蛋白7抗体Abcamab84684
抗骨形态发生蛋白受体2型抗体Abcamab96826
二抗Invitrogen61-6520
GeneLight™双发光报告基因检测试剂盒GenLight BiotechG098
CCK-8试剂盒MedChemExpressHY-K0301
ELISA试剂盒Biovision--
番红O和固绿FCF染色液Sigma-Aldrich--
蔡司Axiovert 200明场显微镜Carl Zeiss--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养与处理
人原代软骨细胞来源(Procell, CP-H107);培养条件(37°C,5% CO2);IL-1β处理浓度(10 ng/ml)和时间(48小时);穿心莲内酯浓度(20 μM);转染试剂Lipofectamine 3000;miR-137 mimic/inhibitor及对照序列。
阅读提示:见Methods 2.2
动物模型
小鼠品系(Balb/C,雄性,6周龄,约20g);OA诱导方式(前交叉韧带横断+内侧半月板切除);分组(5组,每组6只);药物剂量(穿心莲内酯腹腔注射、miRNA抑制剂0.5 mg/kg/周膝关节注射);处理时间(4周)。
阅读提示:见Methods 2.3
分子检测
RT-qPCR内参基因(β-actin);Western blot抗体及稀释比(1:1000);ELISA检测因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β1);统计方法(t检验、ANOVA)。
阅读提示:见Methods 2.4, 2.5, 2.10
双荧光素酶报告基因
报告基因构建(WT和MUT BMP7 3'UTR);转染miR-137 mimic或对照;检测试剂盒(GeneLight™)。
阅读提示:见Methods 2.6
组织学染色
脱钙条件(10% EDTA,pH7.4,21天);切片厚度(6 μm);H&E及番红O/固绿染色。
阅读提示:见Methods 2.9