临床样本分析
检测OA患者软骨中miR-137、纤维化标志物和炎症因子的表达变化。
收集OA患者和对照组膝关节软骨,通过RT-qPCR检测miR-137,免疫印迹检测COL1A1、COL3A1、α-SMA、BMP7、BMPR2,ELISA检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1。
Andrographolide suppresses fibrogenic phenotype of chondrocytes and ameliorates osteoarthritis by regulating miR-137/BMP7 axis.
包含临床样本、IL-1β诱导细胞模型、OA动物模型,并进行了功能验证和机制验证。
人原代软骨细胞 IL-1β诱导的软骨细胞炎症模型 前交叉韧带横断联合内侧半月板切除的OA小鼠模型 OA患者膝关节软骨标本
人原代软骨细胞用10 ng/ml IL-1β处理48小时 穿心莲内酯处理浓度为20 μM miR-137 inhibitor及阴性对照以0.5 mg/kg/周膝关节注射 OA模型采用前交叉韧带横断联合内侧半月板切除 动物实验每组6只Balb/C小鼠
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测OA患者软骨中miR-137、纤维化标志物和炎症因子的表达变化。
收集OA患者和对照组膝关节软骨,通过RT-qPCR检测miR-137,免疫印迹检测COL1A1、COL3A1、α-SMA、BMP7、BMPR2,ELISA检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1。
建立IL-1β诱导的软骨细胞炎症模型,验证miR-137和纤维化标志物的变化。
人原代软骨细胞用IL-1β处理,检测miR-137表达、纤维化标志物水平、细胞增殖和细胞因子分泌。
验证miR-137过表达对IL-1β诱导的纤维化和炎症的影响。
用miR-137 mimic或阴性对照转染软骨细胞,再用IL-1β刺激,检测纤维化标志物、BMP7、BMPR2、细胞增殖和细胞因子分泌。
验证miR-137与BMP7的直接结合及BMP7在纤维化中的作用。
通过TargetScan预测结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证miR-137与BMP7 3'UTR结合,并用siRNA敲低BMP7观察对纤维化的影响。
评估穿心莲内酯对IL-1β诱导的纤维化的影响,并验证其依赖性。
软骨细胞分别用IL-1β、IL-1β+穿心莲内酯、IL-1β+穿心莲内酯+miR-137抑制剂等处理,检测miR-137、纤维化标志物、细胞增殖和细胞因子分泌。
验证穿心莲内酯在动物模型中对OA进展的保护作用,并确认依赖miR-137/BMP7轴。
构建OA小鼠模型,分组处理,检测关节组织学、miR-137和纤维化标志物。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 软骨细胞培养基 | Procell | CM-H107 |
| 白细胞介素-1β | Absin | abs04626 | |
| 药物处理 | 穿心莲内酯 | MedChemExpress | HY-N1490 |
| 细胞转染 | 脂质体3000转染试剂 | Invitrogen | L30000-008 |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| miRNA茎环逆转录试剂盒 | Hubei Apti Bioengineering Co., Ltd | IPD-X049 | |
| SYBR Premix Ex TaqII试剂 | Takara | RR82WR | |
| Western blot | RIPA裂解液 | KeyGen | K10034 |
| 抗I型胶原蛋白1A1抗体 | Abcam | ab260043 | |
| 抗III型胶原蛋白3A1抗体 | Abcam | ab184993 | |
| 抗α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Abcam | ab5694 | |
| 抗骨形态发生蛋白7抗体 | Abcam | ab84684 | |
| 抗骨形态发生蛋白受体2型抗体 | Abcam | ab96826 | |
| 二抗 | Invitrogen | 61-6520 | |
| 双荧光素酶报告基因 | GeneLight™双发光报告基因检测试剂盒 | GenLight Biotech | G098 |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂盒 | MedChemExpress | HY-K0301 |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Biovision | -- |
| 组织学染色 | 番红O和固绿FCF染色液 | Sigma-Aldrich | -- |
| 显微镜 | 蔡司Axiovert 200明场显微镜 | Carl Zeiss | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 人原代软骨细胞来源(Procell, CP-H107);培养条件(37°C,5% CO2);IL-1β处理浓度(10 ng/ml)和时间(48小时);穿心莲内酯浓度(20 μM);转染试剂Lipofectamine 3000;miR-137 mimic/inhibitor及对照序列。 阅读提示:见Methods 2.2 |
| 动物模型 | 小鼠品系(Balb/C,雄性,6周龄,约20g);OA诱导方式(前交叉韧带横断+内侧半月板切除);分组(5组,每组6只);药物剂量(穿心莲内酯腹腔注射、miRNA抑制剂0.5 mg/kg/周膝关节注射);处理时间(4周)。 阅读提示:见Methods 2.3 |
| 分子检测 | RT-qPCR内参基因(β-actin);Western blot抗体及稀释比(1:1000);ELISA检测因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β1);统计方法(t检验、ANOVA)。 阅读提示:见Methods 2.4, 2.5, 2.10 |
| 双荧光素酶报告基因 | 报告基因构建(WT和MUT BMP7 3'UTR);转染miR-137 mimic或对照;检测试剂盒(GeneLight™)。 阅读提示:见Methods 2.6 |
| 组织学染色 | 脱钙条件(10% EDTA,pH7.4,21天);切片厚度(6 μm);H&E及番红O/固绿染色。 阅读提示:见Methods 2.9 |