临床样本收集与临床特征分析
比较脓毒症患者与健康对照的临床指标，确认炎症标志物与脓毒症相关。
收集15例脓毒症患者和8例健康志愿者外周血，检测WBC、PCT、乳酸、PT、肌酐、直接胆红素等指标并进行统计分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
基于脓毒症患者外周血细胞间相互作用的核心预后基因筛选
Screening of prognostic core genes based on cell-cell interaction in the peripheral blood of patients with sepsis.
实验完整度
中包含临床样本转录组分析、公共数据库生存分析和荟萃分析、单细胞RNA测序定位及体外LPS刺激THP1细胞qPCR验证，但缺乏动物模型或功能干预实验。
主要模型
THP-1细胞（PMA分化后LPS刺激） 脓毒症患者外周血（n=15） 健康志愿者外周血（n=8） GSE65682数据集（400例脓毒症患者）
重点核对
脓毒症患者纳入标准：感染+快速序贯器官衰竭评分≥2，年龄16-65岁，排除既往器官功能障碍和免疫抑制患者 差异基因筛选阈值：P<0.01且log2FC≥2 THP-1细胞经PMA（50 ng/mL）刺激48小时，然后LPS（100 ng/mL）处理6小时 基因表达定量：RT-qPCR使用2^-ΔΔCt方法，内参β-actin 生存分析：GSE65682数据集，按基因表达高低分两组，log-rank检验，P<0.05
摘要
对15例24小时内入院的脓毒症患者和8例健康志愿者外周血样本进行RNA-seq。对THP1细胞进行定量PCR，以研究所选关键基因的表达水平。共鉴定出1,128个差异基因，其中721个上调，407个下调。这些基因主要涉及中性粒细胞活化、T细胞调节、免疫效应过程调节、细胞因子受体活性和细胞因子结合。六个靶基因是ELANE、IL1R2、RAB13、RNASE3、FCGR1A和TLR5。在脓毒症组中，FCGR1A和TLR5与生存率呈正相关，而ELANE、IL1R2、RAB13和RNASE3与生存率呈负相关。此外，基于公共数据库的荟萃分析显示，这六个靶基因在脓毒症患者外周血中的表达增加。此外，我们发现单核细胞主要表达这些基因。通过qPCR，我们证实这六个重要基因在脂多糖处理的THP1细胞中高表达。总之，这些发现表明ELANE、IL1R2、RAB13、RNASE3、FCGR1A和TLR5可能影响脓毒症患者的预后，并为脓毒症的治疗提供新的见解和潜在途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脓毒症患者外周血中哪些细胞间相互作用相关的核心基因与预后相关？
- 核心机制
- 未明确阐明机制，但推测这些基因通过影响免疫反应和细胞间通讯影响预后。
- 主要证据
- 基于RNA-seq鉴定1,128个差异基因，PPI网络筛选出六个核心基因；GSE65682生存分析显示ELANE、IL1R2、RAB13、RNASE3高表达与生存率降低相关，FCGR1A和TLR5高表达与生存率提高相关；单细胞RNA测序显示这些基因主要在单核细胞表达；体外LPS刺激THP1细胞验证了高表达。
- 研究意义
- 为脓毒症治疗提供潜在靶点和新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异基因筛选
鉴定脓毒症患者与对照组外周血中的差异表达基因。
对外周血RNA-seq数据进行质量控制、比对、PCA降维，使用DESeq2筛选差异基因。
功能富集与PPI网络分析
探索差异基因涉及的功能通路和蛋白质相互作用。
使用STING数据库构建PPI网络，进行GO分析和GSEA分析，识别核心功能基因。
生存分析
评估核心基因表达与脓毒症患者预后的关联。
使用GSE65682数据集，将患者分为高、低表达组，进行生存曲线分析。
Meta分析验证
在公共数据集中验证核心基因在脓毒症中表达。
从GEO数据库选取5个数据集进行荟萃分析，计算效应量并绘制森林图。
单细胞RNA测序定位核心基因
确定核心基因在脓毒症外周血中的细胞类型定位。
混合5个志愿者样本（2健康、1全身炎症反应综合征、2脓毒症）进行scRNA-seq，聚类并分析核心基因表达。
体外细胞模型验证
验证LPS刺激的THP1细胞中六个基因的表达变化。
THP-1细胞经PMA分化后，LPS处理，使用RT-qPCR检测基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA质量检测 | 安捷伦2100生物分析仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA文库构建 | Ribo-off珠蛋白和rRNA去除试剂盒 | Vazyme | -- |
| Optimal双模式mRNA文库制备试剂盒 | BGI | -- | |
| 测序 | BGI-500 MGISEQ-2000测序系统 | BGI-Shenzhen, China | -- |
| 单细胞测序 | Chromium平台 | 10x Genomics | -- |
| 细胞培养 | THP-1细胞 | Procell CL-0233 | -- |
| RPMI 1640培养基 | ATCC | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素溶液 | -- | -- | |
| β-巯基乙醇 | -- | -- | |
| 佛波醇酯 | -- | -- | |
| 药物处理 | 脂多糖 | -- | -- |
| RT-qPCR | DP419试剂盒 | TIANGEN BIOTECH | -- |
| ReverTra Ace qPCR RT预混液 | TOYOBO | -- | |
| SYBR Green实时PCR预混液 | TOYOBO | QPK-201 | |
| LightCycler96实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 细胞培养 | DAPI染料 | Vector Labs | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 脓毒症患者纳入标准（感染+qSOFA≥2），年龄16-65岁，排除既往器官功能障碍和免疫抑制患者；样本量15例脓毒症，8例对照；外周血采集时间（入院24小时内） 阅读提示：Materials and methods 2.1 |
| RNA-seq | RNA提取方法（TRIzol），文库构建试剂盒（BGI），测序平台（MGISEQ-2000），差异基因筛选阈值（P<0.01, log2FC≥2） 阅读提示：Materials and methods 2.2 |
| PPI网络和功能富集 | 使用STING数据库构建PPI网络，GO分析P<0.05，GSEA的FDR<0.25和P.adjust<0.05 阅读提示：Materials and methods 2.3 |
| 生存分析 | GSE65682数据集，患者分组方式（高/低表达），样本量（每239例），统计方法（log-rank检验，P<0.05） 阅读提示：Materials and methods 2.4 and Figure 4 legend |
| Meta分析 | 使用的GEO数据集（GSE28750等），筛选条件（人、外周血、基因芯片或RNA-seq、16-65岁、样本量≥20），效应模型选择标准 阅读提示：Materials and methods 2.5 |
| 单细胞RNA测序 | 样本混合策略（5个志愿者），10x Genomics平台，细胞聚类方法（Seurat），核心基因定位在单核细胞 阅读提示：Materials and methods 2.6 and Figure 6 legend |
| 体外细胞实验 | THP-1细胞来源（Procell CL-0233），PMA浓度50 ng/mL处理48小时，LPS浓度100 ng/mL处理6小时，RT-qPCR方法 阅读提示：Materials and methods 2.7 and 2.8 |