生物信息学筛选差异表达circRNA
筛选在乳腺癌中差异表达的circRNA候选分子
利用GEO数据库的circRNA表达谱GSE182471，通过R软件分析得到差异表达circRNAs，并选择hsa_circ_001831（即hsa_circ_0001314）作为研究对象。
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基于生物信息学分析的乳腺癌中hsa_circ_0001314相关ceRNA网络的鉴定
Identification of the hsa_circ_0001314-Related ceRNA Network in Breast Cancer With Bioinformatics Analysis.
实验完整度
中包含生物信息学分析、RT-qPCR表达验证、CCK-8、伤口愈合、Transwell和流式细胞术功能实验，但缺乏动物体内实验和双荧光素酶报告基因验证，机制验证不完整。
主要模型
MCF-7人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231人乳腺癌细胞系 MCF-10A人正常乳腺上皮细胞 乳腺癌组织及癌旁组织样本
重点核对
组织样本：15例乳腺癌组织和9例癌旁组织 细胞系：MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A 转染：si-hsa_circ_0001314-1、si-hsa_circ_0001314-2、hsa-miR-548aj-3p mimics及阴性对照 功能实验：CCK-8、伤口愈合、Transwell、流式细胞术 RT-qPCR检测：hsa_circ_0001314、hsa-miR-548aj-3p、MAPK8、MAP3K1
摘要
环状RNA作为竞争性内源RNA，在乳腺癌的发生和发展中起着关键作用。然而，与其他非编码RNA相比，circRNA在乳腺癌中的研究仍处于起步阶段。通过对GEO数据库中circRNA数据集的分析，选择了在乳腺癌中上调的hsa_circ_0001314作为本研究焦点。RT-qPCR分析显示，hsa_circ_0001314在乳腺癌组织和细胞中显著上调。随后，通过CCK-8、伤口愈合、transwell侵袭和流式细胞术分析了hsa_circ_0001314在乳腺癌细胞中的生物学功能。研究表明，敲低hsa_circ_0001314的表达水平显著抑制了细胞增殖、迁移和侵袭能力，同时明显促进细胞凋亡。使用生物信息学方法预测了可能与hsa_circ_0001314相互作用的下游miRNA和mRNA，构建了与hsa_circ_0001314相关的ceRNA调控网络。RT-qPCR证实hsa_circ_0001314作为hsa-miR-548aj-3p的海绵，竞争性结合hsa-miR-548aj-3p以激活MAPK信号通路并调节MAPK8和MAP3K1的表达。研究结果揭示了hsa_circ_0001314作为乳腺癌患者新型预后生物标志物和治疗靶点的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- hsa_circ_0001314在乳腺癌中的表达及其作用机制是否可作为预后生物标志物和治疗靶点？
- 核心机制
- hsa_circ_0001314作为hsa-miR-548aj-3p的海绵，竞争性结合hsa-miR-548aj-3p，进而激活MAPK信号通路，调节MAPK8和MAP3K1的表达。
- 主要证据
- RT-qPCR显示hsa_circ_0001314在乳腺癌组织和细胞中高表达，敲低后抑制细胞增殖、迁移和侵袭并促进凋亡；RT-qPCR验证hsa_circ_0001314与hsa-miR-548aj-3p的负相关关系及对MAPK8/MAP3K1表达的调控。
- 研究意义
- 为乳腺癌的早期诊断和靶向治疗提供新的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
预测circRNA下游miRNA和mRNA
预测hsa_circ_0001314相互作用的miRNA和mRNA，构建ceRNA网络
使用circBank预测靶miRNA，利用GEO的miRNA数据集GSE143564筛选差异表达miRNA，取交集获得候选miRNA；使用miRDB和TargetScan预测靶mRNA并取交集。
GO和KEGG富集分析
分析DEmRNAs参与的生物学过程、细胞组分、分子功能及信号通路
使用DAVID数据库对360个交集mRNAs进行GO和KEGG富集分析，发现多数基因富集于MAPK信号通路。
构建ceRNA网络并筛选hub基因
构建ceRNA调控网络并确定核心调控基因
利用GeneMania构建GGI网络，STRING和Cytoscape构建PPI网络，通过CytoNCA计算介数中心性，选择top 5 hub基因。
验证hsa_circ_0001314表达
验证hsa_circ_0001314在乳腺癌组织和细胞中的表达水平
用RT-qPCR检测hsa_circ_0001314在乳腺癌组织、癌旁组织以及乳腺癌细胞系和正常乳腺细胞中的表达。
功能实验验证敲低hsa_circ_0001314的生物学效应
评估敲低hsa_circ_0001314对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响
将si-hsa_circ_0001314-1和si-hsa_circ_0001314-2转染至MCF-7细胞，通过CCK-8、伤口愈合、Transwell和流式细胞术检测细胞功能。
验证hsa_circ_0001314与hsa-miR-548aj-3p的相互作用
验证hsa_circ_0001314作为hsa-miR-548aj-3p的海绵，调控下游基因表达
在MCF-7细胞中敲低hsa_circ_0001314或过表达hsa-miR-548aj-3p，RT-qPCR检测hsa-miR-548aj-3p和hsa_circ_0001314的表达变化，并检测MAPK8、MAP3K1表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Procell | -- |
| DMEM高糖培养基 | Procell | -- | |
| MCF-10A细胞专用培养基 | Procell | -- | |
| 胎牛血清 | TBDscience | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Biosharp | -- | |
| 细胞转染 | Lipo6000转染试剂 | Beyotime | -- |
| RNA提取与RT-qPCR | TRIzol试剂 | Tiangen | -- |
| FastKing gDNA去除反转录超混合液 | Tiangen | -- | |
| RT-qPCR | Talent qPCR预混液 | Tiangen | -- |
| 增殖实验 | CCK-8试剂 | Biosharp | -- |
| 侵袭实验 | Matrigel基质胶 | ABW | -- |
| 凋亡实验 | V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Biosharp | -- |
| 流式细胞术 | FACScalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 伤口愈合实验 | 显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织样本来源 | 乳腺癌组织样本数量（15例）与癌旁组织（9例）的匹配性、来源医院及伦理审批 阅读提示：Methods, Section 2.7 |
| 细胞系与培养条件 | 细胞系（MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231）的来源、培养基类型及培养条件（5% CO2, 37°C） 阅读提示：Methods, Section 2.8 |
| 转染条件 | siRNA和miRNA mimic的序列、转染试剂（Lipo6000）及转染时间 阅读提示：Methods, Section 2.8, Table 1 |
| RT-qPCR条件 | RT-qPCR引物序列（hsa_circ_0001314、GAPDH、hsa-miR-548aj-3p、U6、MAPK8、MAP3K1等）、内参基因（GAPDH、U6）及定量方法（2−ΔΔCT） 阅读提示：Methods, Section 2.9, Table 2 |
| 功能实验条件 | CCK-8检测时间点（24、48、72h）、伤口愈合观察时间（0、24、48h）、Transwell侵袭时间（48h）及凋亡检测方法（Annexin V-FITC/PI） 阅读提示：Methods, Sections 2.10-2.13 |
| 生物信息学分析参数 | GEO数据集名称（GSE182471、GSE143564）、差异表达阈值（p<0.05, |log2FC|>2）、miRNA和mRNA预测数据库（circBank, miRDB, TargetScan） 阅读提示：Methods, Sections 2.1-2.5 |