细胞系易感性筛选
鉴定PEDV易感和非易感细胞系，以用于转录组分析。
用PEDV假病毒rVSV-ΔG-EGFP-PEDV-S感染9种人细胞系，并通过EGFP表达检测感染；同时用PEDV SD株感染，测定病毒滴度。
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综合转录组分析确定胆固醇转运通路为猪流行性腹泻冠状病毒的治疗靶点
Comprehensive transcriptomic analysis identifies cholesterol transport pathway as a therapeutic target of porcine epidemic diarrhea coronavirus.
实验完整度
高包含体外细胞感染模型、转录组分析(WGCNA)、功能验证(药物抑制、胆固醇促进)及多种病毒株和细胞系验证。
主要模型
Huh7细胞 Vero细胞 LLC-PK1细胞 PEDV假病毒(rVSV-ΔG-EGFP-PEDV-S)感染模型
重点核对
细胞系易感性：Huh7、Vero、LLC-PK1等易感，HeLa、SNU182等非易感 药物处理：依折麦布浓度梯度（0-50 μM），预处理或共孵育 病毒感染：0.1 MOI假病毒或PEDV SD/HM，感染时间1-2小时 检测时间：12或24 hpi，TCID50、EGFP阳性细胞比例、Western blot、RT-qPCR
摘要
猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种高度传染性的病毒，对全球养猪业构成严重威胁。尽管进行了大量努力，但PEDV进入细胞的机制仍然难以捉摸。在本研究中，我们首先通过使用PEDV刺突蛋白假型水疱性口炎病毒鉴定了PEDV易感和非易感细胞系。随后，我们对这些细胞系进行了全面的转录组分析。通过整合差异表达基因分析与加权基因共表达网络分析，我们确定了与PEDV进入相关的关键通路。我们的分析揭示了胆固醇、甾醇和脂质转运与PEDV进入之间的强相关性，提示胆固醇转运在PEDV进入中可能发挥的作用。为了进一步研究，我们用胆固醇转运抑制剂依折麦布处理Huh7、Vero和LLC-PK1细胞，并观察到这些细胞中PEDV进入和随后的病毒复制显著受到抑制。有趣的是，用依折麦布预处理Huh7细胞导致严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）假病毒的进入增加。此外，我们发现胆固醇可以促进PEDV进入Huh7和Vero细胞，而这种促进作用可以被依折麦布阻断。这些发现表明，靶向胆固醇转运可以特异性抑制PEDV进入易感细胞。我们的研究为PEDV进入机制和针对这种具有重要经济意义的病毒开发新的治疗策略提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PEDV进入宿主细胞的关键宿主通路和潜在治疗靶点是什么？
- 核心机制
- 胆固醇转运通路与PEDV进入密切相关，依折麦布通过抑制胆固醇转运（具体独立于NPC1L1）阻断PEDV进入，而胆固醇可促进PEDV进入且被依折麦布阻断。
- 主要证据
- 转录组分析（差异基因和WGCNA）显示胆固醇代谢通路富集；依折麦布处理Huh7、Vero和LLC-PK1细胞抑制PEDV假病毒和真实病毒（G1和G2株）的进入和复制；胆固醇预处理促进PEDV假病毒进入，依折麦布可阻断此效应。
- 研究意义
- 靶向胆固醇转运为PEDV治疗提供潜在策略，并为PEDV进入机制提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组测序和差异表达分析
比较易感和非易感细胞系的基因表达差异，寻找与PEDV进入相关的通路。
提取9种细胞系的总RNA进行RNA-seq，分析差异表达基因，并进行GO和GSEA富集分析。
WGCNA共表达网络分析
识别与PEDV进入相关的基因模块和关键基因。
使用WGCNA包构建共表达网络，计算模块与PEDV进入的相关性，并鉴定模块中的关键基因。
依折麦布对PEDV假病毒进入的抑制验证
验证胆固醇转运抑制剂依折麦布是否能抑制PEDV进入。
在Huh7和Vero细胞中，用依折麦布或25-HC预处理或共孵育，感染PEDV假病毒，检测EGFP阳性细胞。
依折麦布对PEDV复制的抑制验证
验证依折麦布能否抑制PEDV真实病毒的复制。
在Huh7、Vero和LLC-PK1细胞中，用依折麦布处理，感染PEDV SD、HM或rPEDV-HM-EGFP，检测病毒滴度、N蛋白表达和EGFP信号。
依折麦布对SARS-CoV-2和MERS-CoV假病毒进入的影响
检验依折麦布对PEDV的抑制是否具有特异性。
在Huh7细胞中，用依折麦布预处理，感染SARS-CoV-2、MERS-CoV或VSV-G假病毒，检测EGFP阳性细胞。
胆固醇对PEDV进入的促进作用及依折麦布的阻断
确认胆固醇促进PEDV进入，并验证依折麦布可阻断该促进作用。
用胆固醇预处理Huh7和Vero细胞，感染PEDV假病毒；或用依折麦布预孵育后再加胆固醇，检测EGFP阳性细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| RPMI 1640培养基 | Hyclone | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 依折麦布 | Yuanye | -- |
| 25-羟基胆固醇 | MedChemExpress | -- | |
| 病毒感染 | 水溶性胆固醇 | Sigma-Aldrich | C4951-30MG |
| 潮霉素 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| 细胞活力测定 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| 流式分析 | 流式细胞仪 | ACEA | -- |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | Zeiss | -- |
| Western blot | GAPDH抗体 | CST | 5174 |
| PEDV-N抗体 | -- | YY151229 | |
| HRP标记的抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG | Proteintech | SA00001-1 | |
| RNA-seq | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina Novaseq 6000 | Illumina | -- | |
| 质粒构建 | pLV-EF1a-IRES-Hygro载体 | Addgene | 85134 |
| 假病毒包装 | pSPAX2包装质粒 | -- | -- |
| pMD2.G包膜质粒 | -- | -- | |
| pCAGGS-SARS-CoV-2-S质粒 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系易感性筛选 | 细胞系类型、假病毒和PEDV的MOI、感染时间、检测时间 阅读提示：见Materials and methods 2.3 和 Figure 1 legend |
| 转录组分析 | 细胞系数量、RNA-seq平台、差异基因筛选阈值、WGCNA参数 阅读提示：见Materials and methods 2.11-2.13 和 Figure 2-4 legends |
| 依折麦布处理 | 依折麦布浓度、处理时间（预处理或共孵育）、细胞系 阅读提示：见Materials and methods 2.7 和 Figure 5-6 legends |
| 胆固醇处理 | 胆固醇浓度、处理时间、是否加依折麦布 阅读提示：见Materials and methods 2.8 和 Figure 8 legend |