构建肿瘤模型并收集粪便样本
建立皮下和转移性肿瘤模型，并收集肿瘤接种前后的粪便样本以分析菌群变化。
使用MC38和LLC细胞系构建皮下和静脉肿瘤模型，在肿瘤接种前及接种后（皮下18天、静脉未明确）收集粪便样本，同时记录肿瘤体积和体重。
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肠道菌群与肿瘤之间的相互作用：肿瘤可导致肠道菌群失调和代谢失衡。
Crosstalk between gut microbiota and tumor: tumors could cause gut dysbiosis and metabolic imbalance.
实验完整度
高包含细胞系皮下和静脉肿瘤模型构建、宏基因组测序和16S rRNA测序、代谢通路分析、组织学检查及粪菌移植功能验证等多个独立证据层级。
主要模型
MC38皮下肿瘤模型 LLC皮下肿瘤模型 MC38静脉转移性肿瘤模型 LLC静脉转移性肿瘤模型
重点核对
MC38细胞皮下接种剂量3×10^5/位点，LLC细胞5×10^5/位点 静脉接种剂量MC38 3×10^5/只，LLC 5×10^5/只 肿瘤接种前及接种后18天收集粪便 FMT前抗生素鸡尾酒处理7天，包括氨苄青霉素1 g/L、粘菌素1 g/L、新霉素5 g/L、万古霉素0.5 g/L 粪便悬液200 μL/只/天口服灌胃，持续2周
摘要
肠道菌群已被证明与癌症的发生和治疗有关。然而，肠道菌群与癌症发展之间的因果关系仍不明确，值得探索。本研究旨在探讨小鼠肿瘤模型中肠道菌群的改变以及肿瘤与肠道菌群之间的相互作用。利用结直肠癌细胞系MC38和肺癌细胞系LLC构建了皮下和静脉小鼠肿瘤模型。在肿瘤接种前后收集粪便样本进行全宏基因组测序。皮下肿瘤和转移性肿瘤均显著提高了肠道菌群的α多样性。皮下接种肿瘤细胞后，Ligilactobacillus和Lactobacillus的相对丰度降低，而Bacteroides和Duncaniella在转移性肿瘤中减少，与肿瘤类型无关。在物种水平上，皮下和静脉接种肿瘤后，Lachnospiraceae bacterium富集，而Muribaculaceae bacterium Isolate‐110 (HZI)、Ligilactobacillus murinus和Bacteroides acidifaciens的水平降低。代谢功能分析显示，肿瘤接种后，还原性磷酸戊糖循环、尿素循环、酮体生物合成、四氢嘧啶生物合成、C4‐二羧酸循环、异亮氨酸生物合成、肌苷5′‐单磷酸(IMP)和尿苷5′‐单磷酸(UMP)生物合成升高，而辅因子和维生素生物合成缺乏。主坐标分析(PCoA)显示，皮下和转移性肿瘤对肠道菌群的影响部分重叠。此外，粪菌移植显示，改变的菌群可以影响肿瘤生长。综上所述，本研究表明，结直肠癌(MC38)和非结直肠癌(LLC)均可导致肠道菌群失调和代谢失衡，与肿瘤类型和接种过程无关，且这种失调影响肿瘤生长。这项研究为肿瘤与肠道菌群之间的相互作用提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肿瘤是否以及如何影响肠道菌群的组成和代谢功能，以及改变的菌群是否反馈影响肿瘤生长。
- 核心机制
- 肿瘤存在导致肠道菌群失调和代谢失衡，如降低益生菌（Ligilactobacillus、Lactobacillus、Bacteroides、Duncaniella）丰度，增加酮体合成并减少脂多糖合成，且这些改变可影响肿瘤生长。
- 主要证据
- 基于MC38和LLC细胞系构建皮下和静脉肿瘤模型，通过宏基因组测序分析菌群组成和代谢功能，并通过粪菌移植实验证明移植肿瘤前的粪便可抑制肿瘤生长并降低Ki-67表达。
- 研究意义
- 该研究为肿瘤与肠道菌群之间的相互作用提供了新见解，提示肠道菌群可能作为保护因素影响肿瘤生长。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
宏基因组测序及菌群组成分析
分析肿瘤接种前后肠道菌群的多样性、组成和差异。
提取粪便DNA，构建测序文库，进行宏基因组测序，分析α多样性（Shannon、Chao1、ACE）和β多样性（PCoA），并通过LEfSe分析差异菌群。
代谢功能分析
比较肿瘤接种前后肠道菌群代谢功能的改变。
基于宏基因组测序数据，使用DIAMOND比对KEGG数据库，获得代谢通路丰度，并利用LEfSe分析差异代谢模块。
结直肠结构评估
检查肿瘤接种后结直肠黏膜是否有损伤。
对结直肠组织进行HE染色和免疫组化检测ZO-1表达，由病理学家进行组织学评分和绒毛/隐窝高度比评估。
粪菌移植验证菌群对肿瘤生长的影响
验证肿瘤接种前后粪便菌群对肿瘤生长的影响。
用抗生素鸡尾酒清除受体小鼠肠道菌群后，通过灌胃移植肿瘤接种前或后的粪便悬液，随后接种肿瘤细胞，测量肿瘤体积并检测Ki-67表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型构建 | 2,2,2-三溴乙醇 | Macklin | T903147 |
| 粪菌移植 | 粘菌素 | Macklin | C805491 |
| 新霉素 | Macklin | N6063 | |
| 万古霉素 | Macklin | V6062 | |
| 宏基因组测序 | E.Z.N.A.土壤DNA提取试剂盒 | Omega Bio-tek Inc. | M5635-02 |
| Hieff NGS® MaxUp II DNA文库制备试剂盒 (Illumina®) | YEASEN | 12200ES96 | |
| Hieff NGS™ DNA筛选磁珠 | YEASEN | 12601ES56 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | VivaCell | -- |
| 胎牛血清 | VivaCell | -- | |
| HEPES | Procell | -- | |
| 免疫组织化学 | Ki-67抗体 | Proteintech | 28074-1-AP |
| ZO-1抗体 | Proteintech | 21773-1-AP |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | 小鼠品系、周龄、性别、SPF级别；细胞系来源和接种剂量（皮下：MC38 3×10^5/位点，LLC 5×10^5/位点；静脉：MC38 3×10^5/只，LLC 5×10^5/只）；肿瘤体积测量公式；麻醉剂及剂量。 阅读提示：Materials and Methods 2.1 Animal models |
| 粪菌移植 | 供体粪便采集时间（接种前/后）；粪便悬液制备（1g粪便/10mL PBS）；抗生素鸡尾酒种类和浓度（氨苄青霉素1g/L、粘菌素1g/L、新霉素5g/L、万古霉素0.5g/L）及处理周期（7天）；灌胃剂量（200μL/天/只）和持续时间（2周）。 阅读提示：Materials and Methods 2.1 Animal models (FMT部分) |
| 宏基因组测序 | DNA提取试剂盒；文库构建试剂盒；测序平台；质控软件版本（fastp 0.36）；分析软件版本（R、rvegan 2.5-6、lefse 1.1.0、funrich 3.1.3、diamond 0.8.20、microbiotaprocess 1.14.0）。 阅读提示：Materials and Methods 2.2 Metagenomics sequencing and 16S rRNA sequencing |
| 结直肠结构评估 | 组织固定、包埋切片厚度；HE染色；免疫组化条件（抗原修复、封闭、一抗浓度和孵育时间）；组织学评分标准和评估者人数。 阅读提示：Materials and Methods 2.4 Immunohistochemistry and HE staining |