TBEV感染细胞模型建立
建立TBEV感染的Vero细胞模型，用于后续多组学分析。
Vero细胞以MOI=2.0感染TBEV（远东亚型），在感染后0、2、6、12、24、48小时收集样本，每个时间点三个重复，细胞用SDS裂解缓冲液裂解。
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蜱传脑炎病毒感染宿主细胞的多蛋白质组学和相互作用组数据集
Multi-proteomics and interactome dataset of tick-borne encephalitis virus infected host cells.
实验完整度
中包含多时间点多组学分析（蛋白质组、磷酸化蛋白质组、乙酰化蛋白质组）及AP-MS相互作用组分析，并验证了相互作用（co-IP），但缺乏功能验证实验。
主要模型
Vero细胞（TBEV感染模型） HEK293T细胞（病毒蛋白表达及AP-MS模型）
重点核对
TBEV感染MOI=2.0 感染时间点：2, 6, 12, 24, 48小时 三个生物学重复 AP-MS中病毒蛋白带有2×Strep和3×Flag标签 MIST评分阈值≥0.7用于筛选相互作用蛋白
摘要
蜱传脑炎病毒（TBEV）是一种由蜱传播的重要病毒病原体，可引起欧洲和亚洲人类严重的神经系统并发症，凸显了深入了解病毒蛋白分子功能及其与宿主蛋白质组相互作用的迫切需要。多组学分析TBEV如何劫持细胞过程，可提供其复制和致病机制的信息。在此，我们专注于TBEV感染的Vero细胞的蛋白质组、磷酸化蛋白质组和乙酰化蛋白质组，揭示了TBEV感染引发的宿主扰动。此外，我们进行了蛋白质-蛋白质相互作用组分析，以检查TBEV与宿主之间的相互作用。我们提供了技术验证，证明了所有数据集中样本的高质量和相关性，以及病毒感染的细胞在蛋白质组、磷酸化蛋白质组和乙酰化水平上的生物学一致性证据。这个全面的多组学数据集可作为研究TBEV发病机制和确定TBEV治疗潜在药物靶点的宝贵资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TBEV感染如何扰动宿主蛋白质组、磷酸化蛋白质组和乙酰化蛋白质组，以及TBEV蛋白与宿主蛋白之间存在哪些相互作用。
- 核心机制
- 文献未明确验证特定机制，但通过多组学数据揭示了TBEV感染引起的宿主蛋白丰度和修饰状态的广泛变化，以及病毒-宿主蛋白相互作用网络。
- 主要证据
- 通过LC-MS/MS分析鉴定到6077个蛋白质、4483个磷酸化蛋白和2844个乙酰化蛋白；通过AP-MS鉴定到1080个相互作用蛋白，其中375个为高置信度（MIST≥0.7），并用co-IP验证了NS2B-SYVN1、NS5-YTHDC1和NS2B3-FUNDC1的相互作用。
- 研究意义
- 该数据集为研究TBEV发病机制和相关黄病毒提供了全面资源，有助于识别抗病毒干预的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白质组、磷酸化蛋白质组和乙酰化蛋白质组质谱分析
鉴定TBEV感染后宿主蛋白表达水平及磷酸化、乙酰化修饰的变化。
蛋白样本经酶解后，通过LC-MS/MS分析蛋白质组；通过IMAC富集磷酸化肽段后分析磷酸化蛋白质组；通过乙酰化树脂富集乙酰化肽段后分析乙酰化蛋白质组。使用MaxQuant进行蛋白质鉴定和定量。
差异蛋白分析
识别TBEV感染过程中显著差异表达的蛋白。
使用R包MSstats对蛋白质组数据进行log2转换，线性混合效应模型，Benjamini-Hochberg校正，FDR<0.05。
TBEV-宿主蛋白相互作用组分析（AP-MS）
鉴定与TBEV结构蛋白和非结构蛋白相互作用的宿主蛋白。
将编码10个TBEV蛋白的质粒转染HEK293T细胞，表达带2×Strep和3×Flag标签的病毒蛋白，细胞裂解后使用Strep-Tactin柱进行亲和纯化，洗脱蛋白经胰酶消化后进行LC-MS/MS分析。使用MiST算法评分，MIST≥0.7认定为特异性相互作用。
相互作用验证（co-IP）
验证AP-MS鉴定到的关键病毒-宿主蛋白相互作用。
在HEK293T细胞中过表达Flag标记的病毒蛋白或空载体，通过Flag beads进行免疫沉淀，用免疫印迹检测内源性SYVN1与NS2B、YTHDC1与NS5、HA标记的FUNDC1与NS2B3的共沉淀。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | BBI | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Pricella | -- | |
| Vero细胞 | Pricella | -- | |
| HEK293T细胞 | Pricella | -- | |
| 蛋白质组学样本裂解 | SDS裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物III | -- | -- | |
| 烟酰胺 | -- | -- | |
| 曲古抑菌素A | -- | -- | |
| 蛋白质定量 | BCA试剂盒 | Thermo | -- |
| 磷酸化肽段富集 | IMAC微球 | -- | -- |
| 乙酰化肽段富集 | 乙酰化树脂 | Hangzhou PTM Bio-Tech Co., Ltd. | -- |
| 蛋白质组学LC-MS | NanoElute超高效液相色谱系统 | Bruker | -- |
| timsTOF Pro质谱仪 | Bruker | -- | |
| 亲和纯化 | Strep-Tactin® XT纯化柱 | IBA Lifesciences | -- |
| Amicon Ultra-4超滤管 | Millipore | -- | |
| 蛋白质定量 | Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Invitrogen | -- |
| AP-MS质谱分析 | 二硫苏糖醇 | -- | -- |
| EASY-nLC 1200液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Orbitrap Exploris 240质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 转染 | PEI转染试剂 | Yeason | -- |
| 免疫沉淀验证 | Flag琼脂糖珠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒感染 | Vero细胞培养条件，TBEV株（远东亚型）及MOI=2.0，感染时间点 阅读提示：Methods：Cell line and virus infection |
| 多组学样本制备 | 细胞数量（8×10^6），SDS裂解缓冲液配方，添加NAD和TSA，样本合并数（7个T75瓶），裂解后灭活条件（100°C 30分钟） 阅读提示：Methods：Proteome, phosphoproteome, and acetylproteome profiling of TBEV-infected cells |
| 磷酸化肽段富集 | IMAC微球规格，上样缓冲液和洗脱缓冲液配方 阅读提示：Methods：Proteome, phosphoproteome and acetylproteome MS processing |
| 乙酰化肽段富集 | 乙酰化树脂，IP缓冲液配方，孵育时间（过夜），洗脱缓冲液 阅读提示：Methods：Proteome, phosphoproteome and acetylproteome MS processing |
| 质谱分析 | 液相梯度（0-70min 6%-24%B），流速，扫描范围，PASEF参数 阅读提示：Methods：Proteome, phosphoproteome and acetylproteome MS processing |
| AP-MS | HEK293T细胞培养，质粒构建信息，PEI转染条件，亲和纯化步骤，质谱条件 阅读提示：Methods：TBEV-host protein-protein interaction AP-MS methods |