ATL-I抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭
评估ATL-I对RCC细胞的细胞毒性、增殖、迁移和侵袭的抑制作用
使用CCK-8、EdU、集落形成、伤口愈合和Transwell实验检测ATL-I处理后的RCC细胞（786O、OSRC2、ACHN）和正常肾上皮细胞（HK2）的活性、增殖、迁移和侵袭能力。
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白术内酯I通过ATP6V0D2介导的EPAS1/HIF2α自噬降解抑制透明细胞肾细胞癌的血管生成并逆转舒尼替尼耐药
Atractylenolide I inhibits angiogenesis and reverses sunitinib resistance in clear cell renal cell carcinoma through ATP6V0D2-mediated autophagic degradation of EPAS1/HIF2α.
实验完整度
高包含体外细胞实验（增殖、迁移、凋亡）、体内异种移植模型、RNA-seq、蛋白质互作（Co-IP、质谱）及功能验证等多层级实验。
主要模型
786O细胞 OSRC2细胞 ACHN细胞 皮下和原位异种移植瘤模型 HUVEC细胞
重点核对
ATL-I处理浓度（0、80、160 μM）及时间（48 h） ATP6V0D2敲低和过表达 舒尼替尼耐药细胞系SU-R-786O的建立 体内ATL-I给药剂量（50 mg/kg） 体内舒尼替尼和ATL-I联合给药剂量（20 mg/kg和50 mg/kg）
摘要
透明细胞肾细胞癌（ccRCC）与VHL（von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子）突变和血管生成失调密切相关。越来越多的证据表明，消除肿瘤血管生成的抗血管生成治疗可延长ccRCC患者的无病生存期。白术内酯I（ATL-I）是白术根提取物中的主要活性化合物之一，具有多种药理作用，包括抗炎和抗肿瘤作用。在本研究中，我们揭示了ATL-I在ccRCC中的强效抗肿瘤活性。ATL-I通过抑制VHL缺陷型ccRCC中EPAS1/HIF2α介导的VEGFA产生，展现出强大的抗血管生成能力，并通过上调ATPase亚基ATP6V0D2（ATPase H+转运V0亚基d2）促进EPAS1的自噬降解，从而增加溶酶体功能并促进自噬体与溶酶体之间的融合。机制上，ATP6V0D2直接结合RAB7和VPS41，促进RAB7-HOPS相互作用，促进SNARE复合物组装和自噬体-溶酶体融合。此外，ATP6V0D2通过增加巨自噬/自噬后期溶酶体的酸化和活性来促进自噬溶酶体降解。此外，我们发现ATL-I可以降低在舒尼替尼耐药细胞中上调的EPAS1水平，从而逆转舒尼替尼耐药。总之，我们的研究结果表明，ATL-I是一种强效的抗血管生成和抗肿瘤先导化合物，具有治疗ccRCC的潜在临床应用价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ATL-I是否具有抗肿瘤和抗血管生成作用，以及其机制和能否逆转舒尼替尼耐药？
- 核心机制
- ATL-I通过上调ATP6V0D2促进EPAS1的自噬降解，机制涉及ATP6V0D2结合RAB7和VPS41促进RAB7-HOPS相互作用、SNARE复合物组装，以及在后期增加溶酶体酸化和活性。
- 主要证据
- 体外细胞实验、体内异种移植模型、RNA-seq、免疫共沉淀和质谱等方法证明ATL-I通过EPAS1-VEGFA通路发挥抗肿瘤和抗血管生成作用，并逆转舒尼替尼耐药。
- 研究意义
- ATL-I可能作为一种抗血管生成和抗肿瘤先导化合物，用于ccRCC治疗，尤其是针对舒尼替尼耐药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ATL-I诱导细胞周期阻滞和凋亡
探究ATL-I抑制细胞增殖的机制是否与细胞周期和凋亡相关
通过流式细胞术检测ATL-I处理后的细胞周期分布和凋亡率，并通过Western blot检测凋亡相关蛋白和信号通路蛋白的表达。
ATL-I体内抑制肿瘤生长
验证ATL-I在体内对ccRCC肿瘤生长的抑制作用
建立皮下和原位异种移植瘤模型，给予ATL-I处理，测量肿瘤体积和体重，并通过IHC检测MKI67表达。
ATL-I体内外抗血管生成作用验证
验证ATL-I的体外和体内抗血管生成能力
通过HUVEC管形成实验、CAM实验和Matrigel plug实验评估ATL-I的抗血管生成能力，并通过IHC检测VEGFA和PECAM1的表达。
ATL-I通过自噬途径降解EPAS1
探究ATL-I降低EPAS1蛋白表达的分子机制
通过RT-qPCR和Western blot检测EPAS1 mRNA和蛋白水平，使用放线菌酮追踪实验检测蛋白半衰期，使用蛋白酶体和溶酶体抑制剂以及ATG5敲低验证降解途径。
RNA-seq筛选和ATP6V0D2功能验证
筛选ATL-I调控自噬的关键分子并验证ATP6V0D2在EPAS1降解中的作用
通过RNA-seq筛选差异表达的自噬相关基因，并通过RT-qPCR和Western blot验证ATP6V0D2的表达。通过敲低ATP6V0D2检测对EPAS1、VEGFA表达和细胞增殖、凋亡的影响。
ATP6V0D2调控自噬通量和溶酶体功能
明确ATP6V0D2在自噬通量和溶酶体功能中的作用
通过透射电镜、Western blot、RFP-GFP-LC3荧光实验、LysoSensor和LysoTracker染色，以及检测CTSB和CTSD表达来评估自噬流和溶酶体功能。
ATP6V0D2促进自噬体-溶酶体融合的分子机制
探究ATP6V0D2促进自噬体-溶酶体融合的分子机制
通过免疫共沉淀、质谱和GST pull-down实验鉴定ATP6V0D2的相互作用蛋白，并通过共定位和Co-IP验证RAB7-HOPS和STX17-VAMP8的相互作用。
ATL-I逆转舒尼替尼耐药
验证ATL-I是否通过抑制EPAS1通路逆转ccRCC细胞对舒尼替尼的耐药性
建立舒尼替尼耐药细胞系SU-R-786O，并通过CCK-8、凋亡实验和体内异种移植模型评估ATL-I联合舒尼替尼的治疗效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| 嘌呤霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| TRIzol试剂 | Servicebio Technology | G3013 | |
| 药物处理 | 白术内酯I | MedChemExpress | HY-N0201 |
| 舒尼替尼 | MedChemExpress | HY-10255A | |
| 贝伐珠单抗 | MedChemExpress | HYP9906 | |
| MG132 | Beyotime Biotechnology | S1748 | |
| 氯喹 | MedChemExpress | HY17589A | |
| 雷帕霉素 | MedChemExpress | HY10219 | |
| 细胞活性检测 | CCK-8试剂盒 | Yeasen Biotechnology | 40203ES60 |
| 细胞增殖检测 | EdU检测试剂盒 | RiboBio | C10310 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Yeasen Biotechnology | 40303ES20 |
| 细胞周期检测 | 细胞周期染色试剂盒 | Yeasen Biotechnology | 40301ES50 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Servicebio Technology | G3013 |
| cDNA合成 | Hifair II第一链cDNA合成试剂盒 | Yeasen Biotechnology | 11119WS |
| Western blot | RIPA裂解液 | Boster Biological Technology | AR0102 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Boster Biological Technology | AR1193 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Boster Biological Technology | AR1183 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Boster Biological Technology | AR1189 | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | 1620256 | |
| ECL底物 | Bio-Rad | 12003154 | |
| 免疫沉淀 | Protein A/G磁珠 | Biolinkedin | IK1004 |
| 谷胱甘肽-琼脂糖珠 | Biolinkedin | PK2004 | |
| His标签蛋白纯化珠 | Biolinkedin | PK2005 | |
| GST蛋白相互作用Pull-Down试剂盒 | Biolinkedin | IK2004 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
| 山羊血清 | Solarbio | SL038 | |
| DAPI | 文中未明确说明 | -- | |
| 透射电镜 | EPON 812树脂 | Head Biotechnology | E8000 |
| 溶酶体功能检测 | LysoSensor Green DND-189探针 | Yeasen Biotechnology | 40767ES |
| LysoTracker Deep Red探针 | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
| 活细胞染色 | Calcein-AM | Beyotime Biotechnology | C2012 |
| 动物实验 | Matrigel基质胶 | ABW | 8027045 |
| 勃林格殷格翰生物公司 | Boehringer Ingelheim | -- | |
| 特氟龙O型圈 | Chemours | AF | |
| 细胞培养 | 低氧培养箱 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 流式细胞术 | CytoFlex流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| RT-qPCR | StepOne PCR仪 | Applied Biosystems | -- |
| Western blot | 电泳和转膜系统 | Bio-Rad | -- |
| 免疫荧光 | 共聚焦显微镜LSM880 | ZEISS | -- |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜HT7800 | Hitachi | -- |
| 质谱 | Q Exactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 显微成像 | 荧光显微镜IX71 | Olympus | -- |
| 体视显微镜M165 C | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（ATCC、Procell），培养条件（37°C、5% CO2），缺氧诱导条件（0.1% O2） 阅读提示：Materials and methods: Cell lines and tissue samples |
| ATL-I处理 | ATL-I处理浓度（0、80、160 μM）和处理时间（48 h、72 h） 阅读提示：Results: ATL-I inhibits the proliferation, migration, and invasion of RCC cells; Figure 1 |
| 自噬相关抑制剂处理 | MG132浓度（20 μM）、氯喹浓度（10 μM）、雷帕霉素浓度（50 nM）及处理时间 阅读提示：Materials and methods: Chemical reagents; Results: Figure 4 |
| 动物实验 | 小鼠品系（雌性裸鼠）、周龄（5周），细胞接种数量（1×10^6或2×10^6），ATL-I给药剂量（25或50 mg/kg），舒尼替尼给药剂量（20 mg/kg），给药方式（腹腔注射） 阅读提示：Materials and methods: Animal studies; Results: Figure 2, Figure 8 |
| ATP6V0D2敲低 | shRNA靶序列，转染方法（慢病毒），筛选方法（嘌呤霉素） 阅读提示：Materials and methods: Plasmids and cell transfection |