利用CRISPR/Cas9双sgRNA策略高效产生敲除小胶质细胞

在小胶质细胞中进行基因敲除已成为研究神经炎症的重要且令人兴奋的方法，尤其是在过去十年中CRISPR/Cas9系统用于基因组编辑的发展之后。在本研究中，我们描述了一种利用CRISPR/Cas9双短引导RNA（sgRNA）策略高效产生敲除小胶质细胞的方案。富亮氨酸重复激酶2（LRRK2）是帕金森病（PD）的致病基因，在疾病发展过程中扮演多种角色。尽管对LRRK2的研究已获得许多关键见解，但LRRK2在小胶质细胞和神经炎症中的正常及疾病相关功能仍有待充分研究。鉴于LRRK2在PD发病机制中的重要性，我们设计并应用了该方案来靶向LRRK2。具体来说，我们设计了两个靶向LRRK2 N端的sgRNA，跨越5'非翻译区（UTR）和外显子1，并通过单细胞扩增筛选敲除细胞。在实践中，双sgRNA系统可以更方便、快速和准确地获得敲除细胞。候选敲除细胞可以通过基因组PCR和琼脂糖凝胶电泳根据不同的条带大小轻松区分。成功的敲除进一步通过Sanger测序和Western blot验证。使用该方案，我们获得了LRRK2缺陷的小胶质细胞系，其特征是细胞突起更长、粘附增强和迁移能力减弱。敲除的小胶质细胞可能进一步作为重要的细胞工具，揭示LRRK2在PD发展和进展中的保守和新颖功能。我们使用双sgRNA靶向的方案保证>60%的靶向效率，并可应用于靶向其他基因/位点，特别是非编码RNA和调控元件。